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摘要

2014年7月底8月初，阿尔巴尼亚出现了一种新型蓝舌病血清型4 (BTV-4)，蓝舌病暴发影响了绵羊、山羊和牛群。

材料和方法:在本研究中，收集了210头牛的数据，其中56头牛出现临床症状，并进行了密切调查。该亚群是采用竞争性ELISA (cELISA)方法随机检测总IgG存在的牛的一部分。采用血清中和(SN)法检测9种不同蓝舌病血清型的ELISA阳性样品。

结果:在210份牛血清样本中，128份血清血液样本在cELISA检测中存在抗BTV的总IgG阳性。发生BT病的动物最常见的临床症状是产奶量减少、发热、跛行、结膜炎和食欲减退。病死率5.4%。SN试验证实了c-ELISA结果，62.5%(80份)的cELISA阳性样本中存在BTV血清4型抗体，滴度在1:10 ~ 1:640之间。

结论:描述了除绵羊和山羊外的牛发生的BT病的动物流行病暴发和严重的临床疾病。大多数临床感染的牛cELISA阳性，在欧洲已知的9种血清型中，只有BTV血清4型是通过血清中和试验确定的。

关键字

蓝舌病病毒9型血清弱阳性，血清中和，随访

介绍

蓝舌病是一种反刍动物传染病，由呼肠孤病毒科成员蓝舌病毒(BTV)引起，通过某些昆虫作为媒介传播[1-4]。一般来说，牛易受感染，但大多数感染病例具有典型的亚临床病程。由经典24种血清型引起的BT病(BTD)是一种非传染性病毒疾病。在过去几年中，除了通过媒介传播的24种经典血清型外，还发现了新的血清型，如BTV-25、BTV-26、BTV-27[5-7]。最后一种血清型具有一些附加特征，引起无症状感染，直接传播，至少BTV-26[8]具有长病毒血症(BTV-250[9])，并以山羊为宿主。随后可能发生与病媒无关的BTV传播，尽管其重要性尚不完全清楚。已证实BTV-26可能通过气溶胶在牲畜之间直接接触传播[8]。在毛里塔尼亚屠宰场对单峰骆驼进行的一项研究中，还在大量动物身上发现了BTV-26中和抗体，证实本病例中可能在屠宰场发生了水平传播，动物在屠宰前被聚集在一起数天。在一份报告中，在个别动物中发现血清型25病毒RNA至少存在2年，一些山羊的血液在12-19个月时具有传染性[9]。当毒力强的BTV毒株由病媒或易感幼稚动物传入自由地区时，就会出现典型的BTD临床症状[7]。 Cattle are the main mammalian reservoir of BTV. Serologic testing can detect infection and cattle could be used as sentinel animal for BTV surveillance [10]. Identification of BTV serotype is important for vaccination programs, BTD control and for BTV epidemiology studies. Up to last decade, most reference laboratories used traditional identification methods such as: virus isolation, serum or virus neutralization tests (SNT or VNT) [11-13]. Today, there are available advanced molecular methods, which offer several advantages compare to classical methods, however classical method is valid, useful and is advised to use them in parallel with modern techniques.

阿尔巴尼亚的第一例BTD病例记录于1998年，当时BTV-9在反刍动物中传播[14]。从2014年下半年初开始，包括阿尔巴尼亚在内的几个巴尔干国家出现了BTD的动物流行病暴发。所有反刍动物都受到影响;然而有趣的是，与大多数公布的数据相比，绵羊、山羊和牛中有相当大比例的牛表现出临床症状，甚至病死率也更高。暖冬等生态条件有利于媒介昆虫的生长[15]。

本研究的目的是描述2014年阿尔巴尼亚流行的BTD的临床症状和血清型。

材料与方法

在这项研究中，对近距离采集的210头无临床症状和有临床症状的牛的血液样本进行了分析。2014年10 - 11月，采用9ml平面抽真空器采集尾骨静脉血清。所有手术均符合动物福利要求，本研究已于2013年12月获得兽医公共卫生部批准。样品在4°C下保存过夜，在3000 rpm下离心5分钟，收集的血清在-20°C下保存，直到进行血清学测试。此外，还收集了所有取样动物的资料，调查和记录了临床症状和病程。使用竞争性ELISA试剂盒检测血清样品中的总抗体，该试剂盒由史ZooprofilatticoSperimentaleTeramo，意大利，按照制造商说明的程序。ELISA检测结果表示为样品值(S)除以ELISA试剂盒中提供的阳性对照血清值(P)，通过测量光密度(OD)来确定₄₅₀)，使用“TECAN”酶联免疫吸附试验仪［1］。ELISA结果分为阳性和阴性。血清中和试验(SNT)在意大利Teramo BT参比实验室进行。

在Microsoft Excel中使用外接程序data Analysis toolPak(描述性统计)分析数据。

临床研究

210头牛中，只有56头牛表现出临床症状。对每只动物都采用了相同的方案，其中包括以下内容:在畜牧农民或兽医从业者向兽医当局报告临床怀疑BT后执行临床检查。如果在临床检查中遇到临床疑似BT情况，则对所有临床患病动物进行鉴定并取样(血清)。受感染地区被定义为有一只或多只动物在cELISA中检测呈阳性的流行病学单位

血清学试验

竞争ELISA

根据上次调查中最高的血清学患病率和阿尔巴尼亚兽医服务机构报告的最高水平，从10个选定的地区收集样本。所有样本在阿尔巴尼亚和意大利进行平行分析，在阿尔巴尼亚和意大利进行cELISA分析，阳性样本在蓝舌病参比实验室进行血清中和试验[2]来自意大利的泰拉莫。

在阿尔巴尼亚兽医学院动物卫生实验室，使用泰拉莫IZSA&M公司生产的c-ELISA检测了210份牛血清血液样本是否存在总BTV抗体。

血清中和试验

为了确认ELISA阳性结果，所有样本都被送到BT参考实验室，并对阳性样本进行cELISA和SN检测。采用微滴中和法，建立了SN阳性对照和阴性对照。在平底微滴板的每个检测孔中加入50 μ l从1:10到1:1280的几种血清稀释液，并与等体积的国际兽疫局标准参考BTV血清型1、2、4、6、8、9、14、15和16 (100 TCID)混合₅₀)。在37°C, 5% CO中培养₂。孵育1小时后，每孔加入约104个Vero细胞，体积为100 μ l含有抗生素的最低基本培养基(MEM)，孵育4至6天后，使用反向参考BTV血清型读取测试结果。

结果

在210头检测的牛中，61% (95% CI, 59.7-62.3%)为ELISA阳性。128份ELISA阳性样本中，SN检测阳性的占62.5%。仅确认血清型4 (BTV-4)，滴度为1:10 ~ 1:640。临床结果见表1和图1-4。ELISA结果如表1 -3和图5所示。

图1。典型的鼻黏膜病变和结痂

图2。感染BTV-4的牛口腔黏膜糜烂、溃烂

图3。舌头充血/紫色

图4。紫色，乳头病变

图5。阳性动物的滴度分布

表格1.56头牛BTV的主要临床症状及发生频率

受影响的系统	临床表现	个案数目	百分比(%)
一般	发热	55	98.2
	厌食症，体重下降，消瘦	29	51.8
	产奶量下降	56	100.0
运动障碍	残废	39	69.6
	麻痹性痴呆	1	1.8
	Coronitis	31	55.4
粘膜疾病	病变及鼻黏膜结痂	6	10.7
	结膜炎	42	75.0
	口腔黏膜糜烂/溃烂	23	41.1
	舌头充血/紫色	4	7.1
呼吸系统疾病	呼吸困难	11	19.6
	咳嗽	8	14.3
消化系统疾病	厌食症	51	91.1
	唾液分泌	33	58.9
	返流	3.	5.4
	腹泻	3.	5.4
	中止	0	0.0
生殖障碍	充血/紫色，乳头病变	21	37.5

表格2.血清学结果基于cELISA和血清中和试验(在参比实验室进行)。

测试方法	结果
	正面(%)	负	总计
cELISA	128 (61.0)	82	210
在参比实验室进行SN测定(128份cELISA阳性样品)	80 (62.5)	48	128

表格3.基于病毒中和试验的80份样品的血清学滴度按频率分布。

效价	样本数量	百分比(%)
1:10	6	7.5
1:20	4	5
1:40	6	7.5
1:80	14	17.5
1:160	36	45
1:320	10	17.5
1:640	4	5
总计	80	100%

临床研究

受感染动物临床症状出现频率的数据见表1。在牛中记录了感染动物的BTV-4指示性临床症状。BTV-4感染牛最突出的临床症状为:产奶量明显减少、发热、厌食、结膜炎、口腔黏膜结痂/病变、流涎、跛行、冠状炎。

此外，一定比例的动物还出现充血、紫色和乳头病变。较少见的临床症状为轻瘫、反流、腹泻，无流产报告。56只出现临床疾病的动物中有4只死亡。原始数据(图1、2、3和4)显示了2014年BTD暴发期间记录的一些最突出和最明显的临床症状。

基于cELISA和血清中和试验的血清学结果见表2。

血清学结果显示BTD分布广泛。cELISA检测的患病率为61%。

阳性样品的Ab滴度范围为1:10 ~ 1:640。根据抗体滴度，样品所占比例见表3。

讨论

兽医和农民对牛流行性传染病临床症状的认识可能很低，特别是在动物流行病的初始阶段。早在2014年6月底、8月初，兽医从业人员就在包括牛在内的大量反刍动物中观察到异常的临床症状。邻近国家的临床表现和流行病学情况表明存在BTD，经血清学方法诊断并经实验室先进诊断试验证实。从农民和兽医从业人员观察到首次临床症状到向兽医当局正式通报之间的间隔时间相对较长。及时通报非常重要，特别是对于高度传染性疾病。BTD是牛羊的水疱性疾病之一，其他水疱性疾病必须纳入牛羊鉴别诊断范围。其他应纳入牛的疾病鉴别包括牛病毒性腹泻(BVD)、传染性牛鼻气管炎(IBR)、恶性卡他性热(MCF)、光敏化和各种原因的牛口炎[2,4]。只要几乎不存在典型的临床症状，跨界和法定动物疾病的实验室诊断是强制性的[13]。农民有时不喜欢报告法定疾病的早期临床症状;这些助长了感染的进一步传播。 Training and encouraging both farmers and veterinarians to submit samples to the laboratory and reporting disease are key factors for controlling the outbreaks and stopping further spreading.

牛的BTD基因2021版权归OAT所有。然而，一小部分可能会出现临床病例，特别是在新血清型入侵的第一年在幼稚人群中。据报道，在牛中出现了该病的临床发病率和严重程度，但在非洲以外的重大疫情期间，发病率一直远低于绵羊，[2,3]。在自然野外条件下暴露于BTV的牛偶尔会出现与bt感染羊相似的临床症状，但在大多数情况下，这种疾病是不明显的[2]。唯一的例外是感染牛的BTV-8病毒，它们表现出临床疾病。在一项研究中，只有四分之一的接种小牛出现轻度结膜炎，另一个小牛出现上牙龈溃疡，但这是轻微的，小牛没有出现唾液分泌和可检测到的厌食症[16]。畜群中大多数感染BTV-8的牛没有临床影响，但畜群中的少数牛可以表现出明显的临床症状。2006年荷兰爆发的BTV-8型牛暴发导致2.5%的发病率和0.22%的死亡率[16]。在本研究中，血清学结果显示基于cELISA的血清学患病率很高(61%)，只有39%的动物表现出临床症状，超过60%的感染个体未表现出任何临床症状，病死率为7.14%(4只动物死亡)。这可能是由于新血清型对初始人群产生影响，而人群中不存在任何免疫记忆。 The results of ELISA test performed in our laboratory and in Italy were the same. The sera prevalence of BTV infection, based on cELISA results, was 61%.

SN试验证实血清4型，滴度显著高。滴度范围为1:10 ~ 1:640，大部分样品滴度为1:160(45%)。一些阴性的动物可能在它们出血和测试时没有血清转化。我们的研究结果与其他研究结果相当[11,12,17]。研究BTV的流行病学“行为”对控制BTD和减少其对牲畜的负面影响具有重要意义。对牛的BTV进行主动血清监测是识别新的BTV血清型的有效策略，并为减少影响和控制潜在的新动物流行病指明了适当的预防措施。

结论

2014年，一种新的蓝舌病血清型病毒感染了阿尔巴尼亚的反刍动物。尽管BTD是一种典型的绵羊疾病，但牛也受到影响，其中一些表现出严重的临床症状，并有死亡病例记录。临床体征与一般临床体征相关最显著，其次为运动系统和消化道，生殖系统受影响较小。然而，受感染奶牛的乳头病变经常存在。牛的病死率很高，但在报告的限度之内。

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