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摘要

基于环介导等温扩增(LAMP)技术的最新发展，本研究旨在开发一种新的、强大的便携式诊断系统，用于检测小反刍动物重要疾病传染性无乳病的主要病原体。综合诊断系统由一种便携式仪器和一套病原体专用试剂盒组成。试剂盒提供乳中核酸快速提取试剂和LAMP技术扩增试剂，具有较高的检测灵敏度M.agalactiae在牛奶样品中检测限小于100 CFU / ml的DNA，在速度和处理方面超过了传统的实验室诊断，该测试还证明了对影响PCR扩增的牛奶成分的抑制作用更具耐受性。初步结果表明，LAMP系统可作为一种实用、有效的诊断工具，用于肿瘤的诊断M.agalactiae致病源

关键字

现场测试，LAMP，传染性无乳动物，小反刍动物

介绍

传染性无乳症(CA)由四种不同的致病性支原体引起:支原体agalactiae,在地中海地区患病率最高的病原体占诊断率的80%以上，其次是m . mycoides子。卡普里；山羊无性系种群。山羊和m . putrefaciens[1]。由于母羊的产奶量损失巨大、弱羔羊的产量和存活率差、生育率低、疫苗费用以及治疗、时间和劳动力等间接费用，目前，CA是绵羊和山羊畜牧业部门的首要优先事项之一。

迫切需要快速、低成本和用户友好的战略，以便及早诊断疾病和及时治疗，特别是在离诊断实验室很远的地方对动物病原体进行现场筛查。目前用于CA的不同诊断测试不能提供足够快速的反应。像ELISA这样的血清学检测至少要到25-30天才能检测到特异性抗体[2]。抗原本身在受感染乳汁中的排泄只能从感染的第9天起通过培养检测到，必须在此基础上再增加几天，有时甚至几周，以便进行体外分离[3,4]。最近，聚合酶链反应(PCR)因其能够提高反应速度、诊断的敏感性和特异性而得到普遍应用[5,6]。然而，从牛奶中提取致病DNA并不总是那么容易，这仍然是一个既定的事实，因为样品中存在的天然抑制剂阻碍了它们的提取。在实践中，经常观察到抗原水平低的牛奶样品，如在散装牛奶中发生的那样，在检测时可能呈假阴性。PCR还有一些关键因素使其无法在现场使用，包括需要设备齐全的实验室和昂贵的试剂。

这项工作的目的是基于环介导等温扩增(LAMP)技术的最新发展，开发一种新的，强大的便携式诊断系统(ICGene®)，该系统减少了分子生物学的所有经典阶段，克服了传统或实时pcr所需的昂贵实验室设备的使用。新方法可在1小时内直接在现场提供结果，并可自动解释结果。

材料和方法

灵敏度

敏感性试验采用新鲜采集的羊奶，产自无传染性无乳羊群，分装于8管，每管10 ml，在第一管中加入10%的培养物(9ml牛奶中加入1ml)支原体agalactiae(NCTC参考应变代码10123)在最大生长(1X10⁸支原体培养液(mycoplasma broth, Hayflick, Oxoid®)中的菌落形成单位(CFU) / mL。然后从第一个试管中取出1毫升牛奶，在第二个试管中以1/10的比例稀释，直到估计最后一个试管中仍有10 CFU的支原体。与支原体琼脂上的活菌落计数同时检测抗原的确切数量[7]。

特异性

同时，四个羊奶管各含有其他致病性支原体m . putrefaciens，卡普里先生，卡普里先生以及密切相关的牛病原体牛分枝杆菌制备并检验了该方法的特异性。

该综合诊断系统由便携式仪器和病原体专用试剂盒组成(图1)。试剂盒准备使用，并提供从1ml牛奶开始快速提取核酸的试剂和使用LAMP技术的扩增试剂。

图1。LAMP法在农场的应用。

p40基因共使用了6条引物(Rekha V. et al.， 2015): F3(外部正向引物)GGTTTATTAACTGCGTCATCA;B3(互补外部引物)CAACAGTTGCATTCGTCTT;FIP(正向内引物)ACCTTATCACCATTATCTTGTGGATCAGTGCCTTTATTAG;反向内引物;agcataggtgattgtcaaaaatattaggttgcttcaggaattctgctaLF (Forward Loop Primer) gtgaatttttcgttcttatcatcac;LB(反向环引物)

结果

该测试显示，在人工感染的牛奶样本中，检测限低于100 CFU/ ml，在灵敏度上与传统的实验室诊断相当，但在速度和处理方面要好得多。对影响PCR扩增的乳成分的抑制作用也更强。

该系统显示出高特异性，仅识别M.agalactiae而不是来自其他动物支原体的DNA测试或只含有牛奶的控制。

讨论

这些初步结果表明，ICGene®系统可作为一种实用有效的诊断工具，用于肿瘤的诊断M.agalactiae致病源它可以很容易地用于检测其他动物和人类病原体，特别是在世界上诊断实验室与诊断实验室相距许多公里的地区发生的传染性牛和羊胸膜肺炎等支原体疾病。创新测试在速度和鲁棒性方面都是传统实验室测试的重大改进。目前正在继续将这项测试应用于现场，初步结果看起来很有希望。

参考文献

1. 世界动物卫生组织(2012)传染性无乳症。见:陆生动物诊断试验和疫苗手册第七版，世界动物卫生协会，巴黎987-994。
2. 陈建军，陈建军，陈建军，等(1999)绵羊无乳支原体感染的实验研究。新Microbiol22:观众。(Crossref)
3. Loria GR(2008)传染性无乳症。参考文献:反刍动物的支原体病。刘志强，刘志强，刘志强，等(主编)中国生物医学工程学报，1998 - 2013。
4. Nicholas RAJ, Baker S(1998)动物支原体的回收。见:Miles RJ和Nicholas RAJ(编辑)支原体协议，分子生物学方法，第104卷，Humana出版社，Totowa，新泽西州，美国37-43。
5. Tola S, Angioi A, rochigiani AM, Idini G, Manunta D，等。(1997)聚合酶链反应检测羊奶样品中的无乳支原体。兽医Microbiol54: 17-22。(Crossref)
6. 李建军，李建军，李建军，等(2003)支原体的分离与鉴定。临床微生物学杂志41: 4844 - 4847。(Crossref)
7. Postgate JR(1969)存活计数和生存能力。微生物学方法1: 611 - 628。