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摘要

支原体宝是牛呼吸道疾病的一种严重病因，通常与其他细菌和病毒有关，在包括土耳其在内的世界范围内普遍存在。它很难控制，因为抗生素正变得越来越无效，而且没有商业化的疫苗。本研究的目的是检测在土耳其犊牛饲养单位引起呼吸道疾病的感染因子，以确定分离菌株的抗生素敏感性并进行分子分型。在死于肺炎的小牛的病变肺中我们发现牛分枝杆菌存在于所有急性和慢性病变组织样本中。Mannheimia haemolytica主要在慢性组织中检测到(39%)，而在巴斯德菌multocida大多数分离来自急性组织(25%)。对大多数抗生素的最低抑菌浓度(MIC)较高牛分枝杆菌对氟苯尼考、大观霉素、达诺沙星、恩诺沙星、马布沙星中等敏感，MIC50值为8 μg/ml，对林可霉素、克林霉素、图拉霉素敏感，MIC50值分别为1、0.25、0.25 μg/ml。所有测试的都是这两种病毒的分离株m . haemolytica和p . multocida对庆大霉素有抗药性p . multocida分离株对红霉素和泰洛辛的耐药率为100%，对甲氧苄氨嘧啶的耐药率为88%，对四环素和替米霉素的耐药率为75%，对图拉霉素和恩诺沙星的耐药率为50%。的电阻率m . haemolytica对红霉素的分离率为90%，对泰洛菌素的分离率为75%，对四环素的分离率为64%，对甲氧苄氨嘧啶的分离率为55%，对替米科菌素的分离率为36%，对恩诺沙星的分离率为18%，对马布沙星、氟苯尼可、氨苄西林和青霉素的分离率为9%。最后,牛分枝杆菌可以通过分子分型测试分为两个不同的基因簇。

关键字

牛支原体，溶血性曼海姆病，多杀性巴氏杆菌，小牛，肺炎，抗生素敏感性

介绍

牛呼吸系统疾病是全世界养牛场造成重大经济损失的原因。牛肺炎巴氏杆菌病，也称为牛呼吸道疾病(BRD)、牛地方性支气管肺炎或牛呼吸道疾病复合体，是一种由一种或多种病毒、细菌和支原体共同引起的多因素疾病。据估计，BRD是养牛业中最重要的疾病之一，其全球死亡率和发病率估计分别超过幼牛的1%和10%[1]。

支原体宝是世界上最重要和最具致病性的牛支原体。据报道牛分枝杆菌在欧洲造成25- 33%的小牛肺炎[2]，是北美饲养场中最严重的病原体[3]。2006年，来自土耳其西部的第一批报告描述了牛分枝杆菌在小牛饲养单位中，只有不到三分之一的小牛肺部感染肺炎[4]。后来的研究证实了牛分枝杆菌整个土耳其[5]。

牛分枝杆菌通常与其他病原微生物有关，如牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感3型病毒(PI-3)、牛腺病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒1 (BoHV1)、巴斯德菌multocida,Mannheimia haemolytica,Arcanobacterium化脓性链球菌,Histophilus somni,支原体dispar,支原体犬属和Ureaplasma diversum。这些感染因子通常会加重由牛分枝杆菌[2]。

牛支原体病的控制受到日益增加的耐药性的阻碍牛分枝杆菌到四环素和大环内酯类抗生素等常规用于呼吸道疾病的抗生素[6,7]，而且目前还没有商业化的疫苗。一种小牛肺炎的灭活疫苗牛分枝杆菌在实验条件下减少临床发病、体重减轻、肺部病变及向内脏扩散[8]。在英国，自体疫苗取得了一些成功，降低了一些小牛单位的死亡率和治疗费用[9]。然而牛分枝杆菌已经被分子分型试验证明具有遗传多样性[10,11]，因此不能确定一种疫苗能够保护所有菌株。

本研究的目的是检测2015年土耳其犊牛饲养单位引起呼吸道疾病的感染因子，确定分离菌株的抗生素敏感性，并对其进行分子分型牛分枝杆菌菌株wıth的最终目的是生产灭活的自体疫苗。

Materıal和方法

所有诊断工作均于2015年3月至9月期间在彭迪克兽医控制和研究所进行。

样品

对20例急性肺炎犊牛肺和23例慢性肺炎犊牛肺进行了组织病理学检查。所有样本均来自土耳其多个农场的犊牛饲养单位。

分离和鉴定

将肺标本接种于巧克力琼脂上进行分离h . somni[12]并在5%羊血琼脂板(Oxoid)上分离p . multocida和m . haemolytica[1]。使用自动Vitek 2系统进一步纯化和鉴定可疑菌落。

试图从死后标本中分离和鉴定支原体。用于培养的样本包括来自健康组织和病变界面的肺区域的材料[13]。分离株分别在液体和固体伊顿支原体培养基中培养。用半固体琼脂板接种一个充满支原体生长培养的肉汤的环。牛分枝杆菌通过兔特异性抗血清生长抑制试验[14]和PCR/变性梯度凝胶电泳(DGGE) confırmed鉴定[10]。

病毒抗原检测

采用Bio-X Pulmotest tetra ELISA试剂盒检测肺组织中PI、BRSV、BoHV1和BVDV抗原。采用Bio-X腺病毒3酶联免疫吸附测定试剂盒检测腺病毒3抗原。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型

采用PFGE进行基因分型牛分枝杆菌如前所述[15]。简单地说，10 ml固定相培养物通过离心收集，洗涤并在缓冲液中重悬。琼脂糖塞在裂解缓冲液中孵育，然后洗涤。无菌从塞上切下切片，在限制性酶切缓冲液中平衡1小时。根据制造商的说明，用SmaI进行限制性酶切。在CHEF-DRIII系统下，以6 V/cm的电压在1%脉冲场琼脂糖凝胶上进行分离。凝胶用溴化乙锭染色，紫外照相。采用lambda梯形PFGE标记确定片段大小。

常规细菌的药敏试验

采用muller Hinton II型琼脂直接接种法进行圆盘扩散法药敏试验[16]。所使用的抗生素列于表1。

最低抑菌浓度试验(MIC牛分枝杆菌

MIC试验采用微量稀释法进行[6]。所使用的抗生素列于表2。虽然目前尚无offıcial动物支原体药敏试验标准，但我们采用了Ayling指南等.，[6]用于人支原体。MIC值<2的菌株被认为敏感;>2 ~ 8为中间易感，>8为抗性。

结果

细菌检测

20个急性肺肺样本和23个慢性肺肺样本从小牛饲养单位检查的存在牛分枝杆菌以及其他呼吸道疾病病原体。而牛分枝杆菌从所有样品中分离得到，分离率为m . haemolytica是10%(2例)和p . multocida急性肺炎标本占25%(5例)。急性肺炎标本BVDV抗原检测阳性率为18%(2例)。慢性肺炎标本分离率为39%(9例)m . haemolytica13%(3例)为p . multocida。在18%(2例)的慢性肺炎样本中检测到BVDV抗原。h . somni没有从任何样本中分离出来。

抗菌药敏试验

而两者都是孤立的m . haemolytica和p . multocida对庆大霉素有抗药性p . multocida分离株对红霉素和泰霉素的耐药率为100%，对甲氧苄氨嘧啶的耐药率为88%，对四环素和替米霉素的耐药率为75%，对图拉霉素和恩诺沙星的耐药率为50%。的电阻率m . haemolytica对红霉素的分离率为90%，对泰洛菌素的分离率为73%，对四环素的分离率为64%，对甲氧苄氨嘧啶的分离率为55%，对替米科菌素的分离率为36%，对恩诺沙星的分离率为18%，对马布沙星、氟苯尼可、氨苄西林和青霉素的分离率为9%。从急性病例中分离出的菌株比从慢性病例中分离出的菌株具有更高的抗生素耐药性(表1)。

表1。药敏试验m . haemolytica和p . multocida菌株

A*:急性肺性肺

C**:慢性肺性肺

接待员:耐

我:中级

S:敏感

*未经测试

AMP:氨苄西林，AMX:阿莫西林，CTF:头孢非福，ENR:恩诺沙星，ERY:红霉素，FLO:氟苯尼考，GEN:庆大霉素，MBF:马波沙星，PEN:青霉素，SXT:甲氧苄啶-磺胺氧苄沙，TET:四环素，TIL:替尔米科星，TUL:图拉霉素，TYL:泰洛星

麦克风的牛分枝杆菌

菌株对泰乐新、替米科星、红霉素、氯霉素、土霉素、环丙沙星耐药，MIC50值>32 μg/ml，对氟苯尼考、大观霉素、达诺沙星、恩诺沙星、马布沙星中等敏感，MIC50值为8 μg/ml，对林可霉素、克林霉素、图拉霉素敏感，MIC50值分别为1、0.25、0.25 μg/ml(表2)。

表2。最低抑菌浓度牛分枝杆菌菌株(µg / ml)

牛分枝杆菌菌株	1	2	3.	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
	TYL	直到	中国大陆	CLI	非常	的背影	弗洛	SPT	场外	DFX	位	CIP	图尔	兆
BC01/08	32	> 32	2	0.5	> 32	32	8	8	32	8	8	32	1	8
BC02/08	32	> 32	1	0.25	> 32	32	8	8	32	8	32	32	0.5	> 8
英航03/08	8	> 32	0.12	0.12	32	8	8	2	8	0.5	2	2	0.25	0.25
BC04/08	8	> 32	0.25	0.12	32	8	8	8	32	8	8	32	0.25	8
BA05/08	8	> 32	0.25	0, 12	8	8	8	2	32	8	8	32	0.25	8
BC06/08	1	> 32	1	8	> 32	8	8	8	32	8	8	8	1	8
BA07/08	8	> 32	0.12	0.12	> 32	8	8	8	8	8	8	32	0.5	2
BA08/08	8	> 32	0.25	0.25	0.12	8	8	2	32	8	8	32	0.25	0.25
BC09/08	8	> 32	0.12	0.12	8	8	2	2	8	2	8	32	0.25	1
BA10/08	8	> 32	0.5	0.12	32	8	8	8	32	8	8	32	0.25	8
BC11/08	32	> 32	1	0.25	> 32	32	8	8	> 32	8	8	32	0.25	8
BA12/08	32	> 32	1	0.25	> 32	32	8	8	> 32	8	8	32	0.25	8
BA14/08	32	> 32	2	0.5	> 32	32	8	8	> 32	8	8	8	0.5	2
BA15/08	32	> 32	1	0.25	> 32	32	8	8	> 32	8	8	32	0.25	8
BC16/08	32	> 32	1	0.25	> 32	32	8	8	32	1	1	2	0.25	1
BA17/08	8	> 32	1	0.12	> 32	32	8	8	> 32	8	8	32	0.25	8
BA19/08	8	> 32	0.5	0.12	> 32	32	8	8	> 32	8	8	32	0.25	8
BC20/08	> 32	> 32	> 32	> 32	> 32	8	8	8	> 32	> 32	32	32	> 8	8
BC22/08	32	> 32	1	0.25	> 32	32	8	8	> 32	8	8	32	> 8	8
BC23/08	32	> 32	2	0.5	> 32	32	32	8	32	8	8	32	8	> 8
最小值	1	> 32	0.12	0.12	0.12	8	2	2	8	0.5	1	2	0.25	0.25
马克斯	> 32	> 32	> 32	> 32	> 32	32	32	8	> 32	> 32	32	32	> 8	> 8
MIC50	32	> 32	1	0.25	> 32	32	8	8	32	8	8	32	0.25	8

CHL:氯霉素，CIP:环丙沙星，CLI:克林霉素，DFX:达诺沙星，ENR:恩诺沙星，ERY:红霉素，FLO:氟苯尼考，LCM:林可霉素，MBF:马布沙星，OTC:土霉素，SPT:大霉素，TIL:替米科星，TUL:图拉霉素，TYL:泰洛星

指南:<2µg/ml敏感;中间灵敏度>2 ~ <8;> 8抗

病毒抗原检测

在BVDV抗原检测中，18%(2例)的急性肺炎样本呈阳性，18%(2例)的慢性肺炎样本呈阳性。所有样本均未检出腺病毒3、PI、BRSV和BoHV1抗原。

牛分枝杆菌的分子分型

结果显示存在两个主要的集群(图1):第一个集群(A)包含大多数分离株(85%)，第二个集群(B)包含剩余的(15%)。主要的星团可以再细分为两个组。基因型与犊牛死于急性或慢性肺炎之间没有关系。三个农场的犊牛感染了群集A株和群集B株。

图1所示。从患有肺炎的小牛分离的牛支原体株的分子分型显示两个不同的聚集。颜色相同的菌株来自同一头小牛。

讨论

此前有报道称牛分枝杆菌和BVDV在饲养场牛慢性肺炎中起重要作用[17]。在本研究中，发现急性和慢性肺炎样本中BVDV抗原阳性百分比相同。所有样本均未检出腺病毒3、PI、BRSV和BoHV1抗原。从这项研究中可以清楚地看出牛分枝杆菌是从死于呼吸道疾病的犊牛的急性和慢性病变中分离出来的主要病原体。它也可能在土耳其的养牛业中广泛存在[5]，就像它在世界上许多国家一样[18]。

本文所描述的结果证实了其他研究[6,7]的结果，表明许多抗生素对牛分枝杆菌包括泰乐新、替米科星、红霉素、氯霉素和环丙沙星，并对氟苯尼考、大观霉素、达诺沙星、恩诺沙星和马布沙星部分敏感。目前在体外仍然有效的抗生素包括林可霉素、克林霉素和图拉霉素。这里提出的结果令人非常关注，特别是正在发现对氟喹诺酮类药物产生耐药性的证据，这对人类健康来说是令人担忧的，因为这些抗生素往往是治疗耐药感染的最后选择[18]。

而两者都是孤立的m . haemolytica和p . multocida对庆大霉素有抗药性吗p . multocida分离株对红霉素和泰洛菌素、甲氧苄啶-磺胺toxasol和替尔米霉素、土霉素、恩诺沙星和四环素耐药。m . haemolytica分离株对红霉素、泰洛菌素、四环素、甲氧苄氨嘧啶耐药较多，对替尔米霉素、恩诺沙星、马布沙星、氟苯尼考、氨苄西林和青霉素耐药较少。

当耐药在发生和传播时巴斯德菌,Mannheimia和牛分枝杆菌在畜群水平上更好地记录微生物，这一信息将有助于牛从业者最大限度地减少与抗菌素耐药性相关的牛巴氏杆菌病治疗失败的数量。

分子分型的结果证实了McAuliffe等人[15]的报道，他们通过几种分子分型工具报道了两个明显不同的群体的存在，这表明在进化过程中出现了两条不同的血统，一条来自北美，另一条来自欧洲。看来欧洲人牛分枝杆菌毒株可能是由非常相近的毒株变异而来m . agalactiae它是绵羊和山羊的病原体[15]。了解检测到这两种群集菌株但没有记录的农场的临床病史将是很有趣的。可以预期，由于混合菌株有时会导致疾病恶化，死亡率和发病率可能更高[18]。

这里报告的工作表明，迫切需要疫苗来对抗这些感染，因为抗生素显然不起作用。然而，有必要证明疫苗对两种主要群集具有保护作用。

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