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摘要

禽分枝杆菌亚种副结核(MAP)在家养反刍动物和野生物种中引起副结核，也称为约翰氏病，给养殖反刍动物造成经济损失。在葡萄牙，副肺结核的真正群体流行率尚不清楚，而且这种疾病被认为诊断不足。特别是在亚速尔群岛，考虑到牛奶产量的潜在损失，只有很少的研究报告了这种感染。本研究的目的是评估被称为“Brava dos Acores”的利迪亚牛种群中牛副结核病的发病率，该种群注定要进行典型的亚速尔街头斗牛和传统的马术斗牛(在环上)。为此，属于该斗牛种群的68只动物，主要是雌性(n= 55对13只雄性)，年龄在7至223个月之间，通过尾骨静脉采集血液，通过Elisa诊断测试诊断副结核病。结果显示，在68只动物中，63只呈阴性，4只呈阳性，1只可疑。感染动物与阳性和可疑动物的比例为7.4%。

除了获得的新知识外，结论是对该品种的进一步研究将是必要的，以扩大现有的信息。

关键字

莉迪亚牛;副结核;seroprevalence

介绍

利迪亚牛是当地的伊比利亚品种，其生产在西班牙，葡萄牙，特别是亚速尔群岛具有重要的经济和社会意义。在大多数情况下，这种类型的牧场保留了许多传统的动物管理方法和特塞拉-亚速尔群岛的斗牛品种，被称为“Brava dos aaperores”，呈现出自我特征，非常适合绳斗牛，这是这个岛上常见的民族娱乐活动。这种风格包括一群人紧紧抓住一根长而结实的绳子，绳子系在牛的脖子上，称为“tourada corda”(牛在绳子上)。布拉瓦牛品种的繁殖模式是广泛的，许多这些动物在高而难以进入的地区吃草，在那里它们度过严冬，几乎没有牧场，因为这种牛似乎更容易适应不利的现实[1]。影响亚速尔群岛这些动物大多数个体的疾病之一是副肺结核。这种疾病，也被称为约翰氏病，是由一种特定的分枝杆菌引起的传染病:鸟分枝杆菌亚群。副结核(MAP)，除亚速尔群岛野牛外，一般影响所有家养反刍动物[2]，影响动物福利并引起公共卫生问题。其特点是潜伏期长，可达数月或数年，在此期间感染不明显。大多数牛的临床症状表现在2至7岁之间，当动物处于强感染压力的环境中时，可以在较年轻的动物中观察到早期病例[3]。

这种使人衰弱的疾病的第一次描述是在100多年前的欧洲和北美首次发现的，但今天可能更为普遍。感染的风险不仅是农民的经济风险，而且也是人类健康问题，因为有证据表明MAP对人也具有致病性[4]。1894年，Heinrich Albert Johne(因此得名约翰病)和Langdon Frothingham对一头既不产奶也不增重且皮内结核菌试验呈阴性的牛的肠、胃和大肠膜进行了评估[5]。这两位科学家注意到粘膜增厚，白细胞和上皮样细胞浸润肠壁。通过耐酸酒精染色，他们观察到细菌染成了红色，就像那些引起肺结核的细菌一样。在未引起疾病的情况下，他们将感染的组织接种在大鼠身上，得出的结论是病原体与引起鸟类结核病的病原体相同[6]。副结核这个名字来源于对这种细菌的最初描述，这种细菌似乎与引起牛结核病的细菌非常相似[7]。这种病原体可以在环境中存活长达1年。在自然条件下，潜伏期至少为2年，最长可延长至10年[8]。病程取决于受影响个体的年龄、免疫状态和抵抗力[9]。 Persistent infections occur when there is contact with the agent in the first weeks or months of life, especially in the first sucked milk [10]. Normally, the infection begins orally, immediately after the agent is taken up by M cells in Peyer's patches, which appears to be accelerated by colostrum antibodies, present in the intestinal lumen [11]. The macrophages take up bacteria released by M cells and a dissemination, clinically inapparent. After that lesions in the distal jejunum and ileum takes place and chronic enteritis originates with specific granulation tissue [12]. The clinical signs appear mainly after a situation of stress. Observing intermittent diarrhea at first, to later become in permanent and in some cases advanced submandibular edema develops [13]. The transmission of paratuberculosis can occur intrauterine, in the postnatal period through colostrum and, mainly, through the feces of contaminated animals [14]. Although there is no definitive cure for this disease, several agents can be administered to reduce or relieve clinical signs and prolong the animal's life [15]. To detect clinical and subclinical paratuberculosis, tests measuring humoral and cellular immune reactions, are normally employed:

• 补体固定:具有中等敏感性，但在有临床症状的动物中是最有效的方法之一。其缺点是与另一种分枝杆菌发生交叉反应[16]。
• 免疫扩散法(Immunodiffusion in Gel Agar, IDGA):在亚临床病例中敏感性较低[17]。
• 酶免疫测定(ELISA)试验:敏感性与特异性平衡最好，检测亚临床感染动物数量最多。该试验的缺点是与另一种分枝杆菌或诺卡菌存在交叉反应[18]。
• 超敏试验或Introdermoreaction:这些是较老的试验，因为它们不是很具体，因为它们与其他分枝杆菌存在交叉反应[8]。
• 干扰素γ (ifn - γ):用于检测处于感染早期阶段的幼龄动物。缺点是特异性低，成本高[19]。

细菌学诊断是通过回肠涂片和/或粪便培养进行的，这比ELISA测试贵2-3倍。否则，在2 ~ 4个月之前无法获得结果。然而，这种诊断方法的优点是它的高特异性。死后诊断是基于大体病变和组织病理学以及器官内细菌的鉴定，使用免疫组织染色Ziehl-Neelsen检测结核分枝杆菌有机体及其在组织中的精确定位[20]。

在控制和预防方面，没有有效的副结核病治疗方法，试图治疗受感染的动物，可能会使其在农场停留期间感染其他动物[21]。因此，预防这种感染是在畜群中控制副结核病的最有效方法。因此，有必要建立副结核病的控制方案，这包括几个挑战，例如它是一种亚临床阶段的疾病，发展缓慢，难以识别和控制畜群的感染水平[3]。为了从农场中消除副结核病，必须完全减少人口并重新引入新的未感染的动物，最好的选择是将疾病的流行率保持在非常低的水平。因此，副结核病的控制应基于两个原则:通过诊断测试识别受感染的动物，以及预防新的感染，包括隔离和消除受感染的动物，良好的卫生习惯和防止受感染动物进入农场[21,22]。

目前，在大多数国家，控制措施的实施仍然完全依赖于业主，如管理、工作和财政资源[23]，如欧盟，没有副结核病控制规划[6]。在实施副结核病控制计划时，必须考虑到没有静态计划，因此这种控制必须考虑猪场的特殊性。其中一个主要因素是养殖场现有资源的可用性，因为这种控制是基于预防性管理和良好管理做法。农场的经济实力是另一个需要考虑的因素，因为它会影响诊断测试的投资和要抑制的阳性动物的数量。

一个主要的感染控制点是农场的总体卫生，考虑到受污染牧场的休耕时间不应少于三年，应保持喂食者和饮用者的高度清洁[23]。虽然接种疫苗是减少出现该疾病临床表现的动物数量的良好做法，但接种疫苗的动物不能被认为没有疾病[24]。已知几种动物存在感染MAP的风险，因此怀疑该感染也可能发生在人类中[3]。这种感染已在克罗恩病患者中通过CRP检测到，克罗恩病在流行病学和病理学上与副结核病相同[25,26]。克罗恩病的特点是慢性炎症过程，主要影响胃肠道，与副肺结核相似[3]。MAP引起克罗恩病的可能性是在1984年的一系列研究中发现的，他们在克罗恩病患者体内分离出了微生物[27]。这两种疾病影响成年人和年轻人，以慢性肉芽肿病变为特征，通常集中在回肠末端，并表现为腹泻和体重减轻的临床症状[28]。克罗恩病已经得到了有效的治疗，在某些情况下，甚至可以通过长效抗生素治愈。然而，需要专门从事MAP培养的实验室从克罗恩病患者身上采集样本，才能证明MAP是人类疾病的病因之一[26]。

大多数感染MAP的动物是农场动物，因此，考虑到MAP可以在肌肉、内脏和牛奶中分离出来，它们生产的食品在屠宰供消费之前必须对污染进行称重。污染可能发生在死前、已经感染的动物身上或在屠宰线处理粪便污染的过程中。牛奶也是同样的情况，它可能来自已经感染的动物，也可能来自粪便污染[29]。

由原料奶制成的高湿度和pH的奶酪被MAP污染的可能性很高[26]。生活用水也应被视为人类的污染源，例如，落在受感染畜牧生产区的雨水可能含有生物体超过一年，而分枝杆菌MAP对水消毒中使用的氯含量具有抗性[26]。

根据世界动物卫生组织的说法，必须进行进一步的研究，以确定食用受MAP污染的食品对公众健康的真正风险。关于如何减少人类接触这种潜在的人畜共患病原体，仍有许多工作有待调查。

与传染病有关的问题代表了广泛的牛，并且以独特的方式对Lidia牛来说是潜在经济损失的主要风险来源[30,31]。在所有这些病原体中，他们强调了对生殖系统、呼吸系统和消化系统有明显倾向的病原体。因此，繁殖潜能的变化以及呼吸消化系统的紊乱是我们在繁殖过程中面临的主要问题[32]。副结核病存在于大多数Lidia牛群中，并对实施控制策略造成困难，因为它具有很长的潜伏期，并且在大多数动物中具有亚临床感染。在亚速尔群岛，特别是特塞拉岛，在20世纪最后几十年和21世纪初，这种疾病随着从伊比利亚半岛进口的牛而传播[33]。此外，由于这些动物在所有岛屿上流通，这一事实有助于该疾病在群岛的传播[33]。

材料与方法

本研究选用在“阿布拉瓦”品种名册中登记的68只动物，其中雌性55只，雄性13只，平均年龄为83.07±7.3月龄。它们都在亚速尔群岛Terceira岛的高海拔(夏季/秋季)和中海拔(冬季/春季)放牧。在动物挤压状态下从尾骨(尾)静脉采血(10 ml)，并在出血24小时内送到地区兽医实验室，分离血清或血浆样本并在- 20°C保存，直到进行分析。采用间接吸收ELISA(酶联免疫吸附法)检测鸟分枝杆菌亚种副结核抗体，根据[34]检测血浆中的副结核抗体。简单地说，用分枝杆菌的可溶性抗原去除牛血清中的非特异性抗体。在将牛血清样本转移到涂有(MAP)抗原的培养皿之前，牛血清样本被稀释，并用含有支原体抗原的稀释缓冲液预孵育。在微孔中添加抗反刍免疫球蛋白G和马萝卜过氧化物酶(HRP)。洗涤后，加入底物溶液四甲基联苯胺(TMB)去除多余的共轭物。在葡萄牙亚速尔地区兽医实验室，用分光光度计(ELISA阅读器，Bio Rad-Model 620)在450nm处读取微孔板。所有elisa阳性样品均在培养基中培养(每个样品3管含mycoactin的Herrold蛋和1管不含mycoactin的Herrold蛋)。

采用SPSS统计软件进行简单方差分析，P <0.05为差异有统计学意义。计算MAP患病率与动物年龄以及研究动物是雄性还是雌性的关系。

结果

表1给出了诊断为副结核的动物的频率和百分比。可以看出，在68只被评估的动物中，63只(92.6%)为阴性，4只(5.9%)为阳性，1只(1.5%)结果可疑。

表1。与副肺结核有关的动物分析的频率和百分比。

男性和女性之间的患病率值没有表现出对病原体鸟支原体亚种的不同反应。副结核。在55名女性中，副结核病阳性的只有4名，而在13名男性中，阳性的只有1名，分别占72.7%和76.9%。

与年龄相关，10岁以上动物血清阳性率最低(0.0%)，2 ~ 4岁动物血清阳性率最高(4.7%)，差异均有统计学意义(p<0.05)。

讨论

鸟分枝杆菌亚种副结核菌病是反刍动物严重肠胃炎的病原，被称为约翰氏病。它被认为是反刍动物的一种慢性进行性肠炎，在世界范围内传播，造成重大的经济损失并影响受感染奶牛的生产力[35]。在本研究中，研究人员对68只斗牛犬进行了分析，其中13只雄性，55只雌性。结果表明，从我们的样本中，63只动物被认为存在副结核病阴性，4只呈阳性，1只可疑。此外，在女性和男性的患病率之间没有观察到统计差异，年龄被认为是影响患病率的一个因素。众所周知，反刍动物在生命早期通过摄入被map污染的牛奶或接触受感染畜群的粪便而感染[36]。患有晚期疾病的怀孕奶牛可能会将其传染给胎儿[37]。此外，通常认为动物在出生后的最初几个月内就会被感染[38]，由于该病潜伏期较长，通常仅在成人中才会出现临床症状[28]。

关于年龄，已经观察到，最年轻的动物的患病率高于最年长的动物。同样，被认为有问题的雄性也是一只幼崽，只有23个月大。在成年动物和小牛之间观察到的易感性差异的原因尚未完全阐明。牛体内大量的gd T淋巴细胞在它们最容易感染MAP的时候，以及它们在粘膜皮肤组织中的特殊位置，也代表了分枝杆菌病原体的首选进入点，被认为与感染的维持有关[28]。其他物种如羊和鹿可在任何年龄被感染，并表现出该病的临床症状[39]。

在野生牛育种中，雌性被用作繁殖者，可以在牛场饲养数年以产生后代。新的雌性，根据牧场主的目标经过几个选择标准后，用来取代老的雌性。为了在斗牛比赛中奔跑，雄性被培育到3岁。然后，根据它们的特点和在斗牛中的表现，它们可以活几年，甚至可以成为繁殖者。

感染动物与阳性和可疑动物的比例为7.4%。如前所述，副肺结核是一种传染病，没有有效的治疗方法可以彻底消除MAP。因此，必须尽快对检测结果呈阳性的4头母牛进行鉴定和分离，并将其屠宰，以避免未来污染其他动物，这可能导致农场污染比例增加，造成巨大的经济损失。这4只母鼠的后代也应被挑选出来进行分析，因为副结核可通过初乳和乳汁中的分枝杆菌传播，也可通过经胎盘途径传播。此外，大多数感染发生在出生后不久，这是动物最容易感染的时候。6个月后，牛对感染的抵抗力更强，需要更高的剂量才能引起感染。至少25%的严重感染的奶牛通过胎盘将疾病传播给胎儿，并在牛奶中排出微生物。受感染的公牛在精液中会流出生物体，但尚未证实是性传播。因此，被认为可疑的男性也应与其他人分开，进行另一次检测，直到确认其是否存在副肺结核。如果未来的结果是肯定的，最好的解决方案是屠宰，以避免污染剩余的动物，但由于这些动物几乎是两岁(23个月)，这只牛可以与其他动物分开繁殖，以避免污染，然后在3岁时用作斗牛，即使它失去了屠宰，也会给开发带来偏见。

今后我们希望制定一个控制计划，有两个原则:确定感染源和预防新的感染。

为了确定感染源，可以使用诊断测试对农场的所有动物进行分析，以确定受感染的动物。由于土壤也可能是感染源，因此观察污染程度将是非常有趣的，因为在完全阴凉的箱子中，通过将受感染的粪便材料施用于土壤表面发芽的草上，生物体可存活长达24周，在70%遮荫的草上可存活长达9周[40]。引进新动物也可能是感染源，如在畜牧场，为了改良品种，有时使用来自其他畜牧场的种畜，必须对这些动物进行诊断测试，以确保它们不是感染源[41]。

预防新的感染源将涉及隔离和丢弃被认为是感染源的动物，这些喂食器实际上位于地面，因此在更高的位置建立新的喂食器是避免食品污染的一项资产。在土壤层面，如果牧场受到污染，则必须将其搁置至少三年。最后，注意引进新动物。

对野生种副结核病的进一步研究将是扩大现有信息的必要条件。目前的大部分信息都与牛奶和肉类品种有关，因为它们的行为和管理与利迪亚牛品种非常不同。

鸣谢

该项目85%的资金由联邦储备局提供，15%的资金由区域基金通过2020年亚速尔行动计划(2020年亚速尔行动计划)提供，项目范围为BEMAP-ET - acores -01-0145-联邦-000026。

资金

IITAA(亚速尔大学)得到充分认可。项目85%的资金由联邦储备基金提供，15%的资金由区域基金通过项目CRYOTEC-AÇORES-01-0145-FEDER-000092范围内的2020年阿 ores业务方案提供。

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