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摘要gydF4y2Ba

本试验测定了饲粮中三聚氰胺对犊牛21 d的毒性。30头断奶后2周的犊牛(初始体重10.66±1.52 kg)，分别接受6种饲粮处理。每种饲粮处理分别饲喂5头猪。饲粮的三聚氰胺(MEL)含量分别为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00和1.25%。根据试验期间的平均采食量和增重可知，饲粮水平为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00和1.25%时，猪的日摄食量分别约为0、134、276、400、558和714 mg/kg BW/d。另外2头猪饲喂0.75%三聚氰胺和0.75%三聚氰尿酸的组合饲料，为期18天。研究期间无死亡发生。与对照组相比，加入≥1.00%的三聚氰胺可降低体重和平均日增重。与对照组相比，饲喂1.25%三聚氰胺的猪的饲料增重较低。相对肝肾重量和血清肌酐不受治疗的影响。 In contrast, barrows fed the combination of melamine and cyanuric acid had relative kidney weight that were 82% heavier than controls and a creatinine level that was approximately seven-fold greater than that of controls. Urine from pigs fed the combination of melamine and cyanuric acid contained a moderate amount of crystals that were consistent with melamine-cyanuric acid complexes. No histologic change was noted in the liver, kidney, or muscle sections from pigs fed only melamine. However, kidneys from pigs fed the combination of melamine and cyanuric acid contained a large number of golden brown to yellowish crystals in the tubules. Melamine residue levels of pigs fed a combination of melamine and cyanuric acid (0.75% each) were lower than in pigs fed 0.75% melamine alone.

关键字gydF4y2Ba

晶体，三聚氰尿酸，肾脏，三聚氰胺，猪肉gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

梅尔:三聚氰胺;CYA:三聚尿酸;BUN:血尿素氮;创造:肌酐;BW:体重;科学:No-Observed-Adverse-Effect-Level;超高效液相色谱串联质谱法;CBC:全血细胞计数;WBC:白细胞;RBC:红细胞; HGB: Hemoglobin; HCT: Hematocrit; MCV: Mean Corpuscular Volume; MCH: Mean Corpuscular Hemoglobin; MCHC: Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration; PLT: Platelets; GLU: Glucose; Na: Sodium; K: Potassium; Cl: Chloride; ALB: Albumin; TP: Total Protein; GLOB: Globulin; Ca: Calcium; Phos: Phosphorus; Mg: Magnesium; T Bil: Total Bilirubin; D Bil: Direct Bilirubin; AST: Aspartate Aminotransferase; GGT: Gamma-Glutamyl Transpeptidase; CPK: Creatine Phosphokinase; BWG: Body Weight Gain; FI: Feed Intake; HPLC: High Pressure Liquid Chromatography; ADG: Average Daily Gain

介绍gydF4y2Ba

三聚氰胺(CgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaHgydF4y2Ba_6gydF4y2BaNgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba;MEL)是一种白色结晶粉末[1]，具有广泛的工业应用，包括用于制造塑料，粘合剂，层压板，油漆，阻燃剂，纺织品整理剂和肥料[2]。氰尿酸(CYA)与氨胺和氨酰都是MEL的结构类似物[3,4]，都属于s-三嗪类化学品[5]。MEL和CYA自组装并形成氢键双分子网络的能力[6]使这些化合物在摄入它们的动物肾脏中结晶，导致肾功能衰竭[7]。gydF4y2Ba

通过使用含有MEL或CYA的产品处理饲料原料，可以间接和意外地发生MEL和/或CYA对饲料或食品的污染[4]。然而，近年来，在饲料和食品中故意掺假MEL的行为[2]引起了国际上的关注。MEL是66%的氮[8]，因此，使用凯氏定氮法进行蛋白质分析将导致对含有MEL的基质实际蛋白质含量的无效或高估[8]。因此，人们有意将MEL添加到饲料原料和饲料中，以增加其货币价值[9]。一些作者已经报道了MEL-CYA晶体在狗和/或猫的肾脏中的沉淀[9-11]。也有报道[10,12]，MEL和CYA喂养的动物由于肾功能下降，血尿素氮(BUN)水平升高。MEL和相关化合物的可能吸收途径，以及这些化合物的沉淀如何导致肾损害和肾功能衰竭，此前已有报道[12,13]。gydF4y2Ba

2007年，在北美和南非，因食用被MEL和CYA污染的宠物食品而导致的肾衰竭导致宠物死亡[2]。随后确定将含有MEL和CYA的宠物食品残渣掺入猪、家禽和水产养殖饲料中[14-16]。食用受污染饲料的动物被美国农业部食品安全检验局隔离，直到确定这些动物的肉类和其他产品本身没有受到污染[16]。gydF4y2Ba

2008年9月，来自中国的报告显示，52,875名儿童在食用了受MEL污染的婴儿配方奶粉和其他相关乳制品后，因肾脏并发症而接受治疗[4,17]。截至2008年11月，中国约有29.4万名婴儿受到感染，其中5万人住院，6人死亡[4,17]。经确定，MEL被用于人为增加用于婴儿配方奶粉生产的牛奶的粗蛋白质[4,18]。然而，与2007年宠物食品事件不同的是，牛奶中添加的三聚氰胺相对较纯，氰胺、氨酰和氨酰的含量约为MEL含量的0.1%[4]。与2007年宠物食品中存在的氰胺、氨基苯胺和氨基苯胺污染水平相比，这一污染水平要低得多[4]。gydF4y2Ba

自2007年和2008年MEL及相关类似物污染动物饲料和人类食品事件以来，已经发表了一些涉及猪食用MEL及相关化合物的病例报告和实验[19-21]。泰国一家农场的猪初级饲粮中MEL、CYA和氨基盐的浓度分别为3209 ppm(占饲粮的0.32%)、1126 ppm(占饲粮的0.11%)和949 ppm(占饲粮的0.09%)[21]。断奶后约两周死亡率开始上升，两个月内接近100%。受感染猪的肾脏呈黄色，微肿，有光泽，并表现为肾周水肿。肾切面表面可见晶体沉淀，晶体呈黄色至棕色，呈放射状条纹[21]。马来西亚猪日粮中MEL的浓度从750 ppm(日粮的0.075%)到1500 ppm(日粮的0.15%)不等[20]。食用受污染饲料的猪表现出食欲不振、厌食、消瘦、迟钝和抑郁。这些猪的肾脏肿大，外观呈黄色。严重感染猪的肾脏体积小，有明显的凹陷和凹陷，颜色为深红色和棕色，皮质有多个囊肿[20]。gydF4y2Ba

关于猪MEL消耗的第一个实验数据是饲喂400 mg/kg体重(BW;？在16周龄约克郡杂交猪中单独或联合添加MEL和CYA(占日粮的0.7%)[22]。饲喂期为3天，每组1头猪。单独饲喂MEL和CYA的猪肾脏无明显病变或结晶，BUN和肌酐(CREAT)水平正常。只有饲喂组合日粮的猪在肾脏中形成径向球形聚集体的金棕色晶体。组合饲猪的BUN和CREAT水平也有所升高。作者报道了一个有趣的观察结果，MEL-CYA和mel -尿酸晶体在福尔马林中可能不稳定，当组织在福尔马林中固定时，它们会溶解[22]。gydF4y2Ba

2011年，在猪中确定了未观察到的不良反应水平(NOAEL)[23]。对断奶仔猪分别饲喂MEL、CYA或MEL+CYA的组合进行了三项独立研究。第一项研究发现，当MEL-CYA饲粮水平大于10 mg/kg体重/天(?0.025%)。每天喂食10 mg/kg体重或更多MEL-CYA组合的小鼠，在肾髓质和皮质中发现了晶体结构，而每天喂食200 mg/kg体重(?0.50%的膳食比例)。在第二个实验中，进行了NOAEL测定，0.0、1.0和3.3 mg/kg体重/天(?将MEL-CYA添加量分别为饲粮的0.0、0.0025和0.00825%，饲喂28 d[23]。只有一只被喂食3.3 mg/kg BW/天的雄鼠肾脏出现了晶体簇，因此NOAEL设定为1.0 mg/kg BW/天MEL联合1.0 mg/kg BW/天CYA。最后，通过饲喂200 mg/kg BW/天的MEL进行后续研究。 Upon examination no crystals were present in pigs fed 200 mg/kg BW/day [23].

在NOAEL实验中，采用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定晶体组成[23]。结果表明，仅饲喂MEL的猪肾脏中晶体的形态与MEL和CYA联合饲喂的猪肾脏中晶体的形态密切相关。UPLC-MS/MS测定的相似形态和MEL与CYA的1:1比例表明MEL喂养猪的晶体同时含有MEL和CYA[23]。据报道，虽然已经报道了MEL转化为CYA的微生物[5,7]，但尚不清楚负责转化的微生物是否存在于动物的胃肠道中并具有活性[23]。gydF4y2Ba

先前的研究已经确定MEL和CYA组合可以形成与宠物相似的肾脏晶体[22]，并建立了MEL和CYA组合喂养猪的NOAEL[23]。然而，到目前为止，还没有研究解决了高MEL日粮水平对断奶仔猪或消费后组织残留物水平的影响。因此，本研究的目的是确定高饲粮MEL水平(高达饲粮的1.25%)对断奶仔猪的影响，并确定MEL在肾脏、肌肉和胆汁中的残留水平。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

饮食准备gydF4y2Ba

基础日粮(表1)的配制应满足或超过美国国家研究委员会建议的断奶猪的所有要求[24]。在基础饲粮中添加MEL(来自Fisher Scientific (St. Louis, MO, USA))制备6个饲粮处理。用三聚氰胺代替沙子获得所需的日粮MEL浓度(0.00、0.25、0.50、0.75、1.00和1.25%)。gydF4y2Ba

表1gydF4y2Ba．基础日粮的成分和营养组成。gydF4y2Ba

成分gydF4y2Ba	成分(%)gydF4y2Ba
玉米gydF4y2Ba	49.77gydF4y2Ba
大豆粉gydF4y2Ba	27.50gydF4y2Ba
乳清,干gydF4y2Ba	10.00gydF4y2Ba
等离子体gydF4y2Ba	2.50gydF4y2Ba
选择白色油脂gydF4y2Ba	5.00gydF4y2Ba
磷酸氢钙gydF4y2Ba	2.05gydF4y2Ba
石灰石gydF4y2Ba	0.87gydF4y2Ba
维生素预混料gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	0.50gydF4y2Ba
盐gydF4y2Ba	0.20gydF4y2Ba
赖氨酸gydF4y2Ba	0.15gydF4y2Ba
微量矿物预混料gydF4y2BabgydF4y2Ba	0.15gydF4y2Ba
DL-MethioninegydF4y2Ba	0.065gydF4y2Ba
沙子gydF4y2Ba	1.25gydF4y2Ba
总计gydF4y2Ba	100.00gydF4y2Ba
营养成分(计算)gydF4y2Ba
粗蛋白质(%)gydF4y2Ba	20.5gydF4y2Ba
代谢能(千卡/公斤)gydF4y2Ba	1580.00gydF4y2Ba
赖氨酸(SID， %)gydF4y2Ba	1.20gydF4y2Ba
蛋氨酸(SID， %)gydF4y2Ba	0.34gydF4y2Ba
蛋氨酸+半胱氨酸(SID， %)gydF4y2Ba	0.68gydF4y2Ba
苏氨酸(SID， %)gydF4y2Ba	0.72gydF4y2Ba
钙(%)gydF4y2Ba	0.95gydF4y2Ba
磷(% Av.)gydF4y2Ba	0.55gydF4y2Ba

1. 提供的维生素预混料(mg/kg日粮):醋酸视黄酯，11000 IU;胆钙化醇，1100 IU;DL-α-生育酚乙酸酯，44.1 IU;甲基萘醌钠二甲基嘧啶硫酸酯，4.0;维生素BgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba， 30.3µg;核黄素，8.3毫克;d -泛酸钙，28.1 mg;烟酰胺，33.1 mg;氯化胆碱551.3毫克;d -生物素，0.22 mg;叶酸，1.65毫克gydF4y2Ba
2. 提供微量矿物质预混料(mg/kg日粮):Zn, 165 mg (ZnSO4);铁，165 mg (FeSO4H2O);Cu, 16.5 mg (CuSO45H2o);Mn, 33 mg (MnSO4);1、0.3 mg Ca(IO3)2;硒，0.3 mg (Na2Se03)。gydF4y2Ba

SID =标准化回肠消化基础。gydF4y2Ba

猪、管理和响应变量gydF4y2Ba

动物护理和使用协议由密苏里大学动物护理和使用委员会审查和批准。断奶两周后，从商业生产者处购买了30头驴，称重，贴耳标签，并将其放置在单独的围栏中，可以自由地获得饲料和水。试验采用完全随机设计，每组5个重复猪圈，每组1头猪。猪被安置在一个1.2米高的环境控制建筑中gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在冲洗系统上有塑料覆盖的栅栏地板的钢笔。每只猪圈都有一个不锈钢奶嘴和一个三孔的喂食器。饲粮处理21天，每头猪每天检查有无疾病迹象。gydF4y2Ba

第21天，前3个重复每头猪取2份血样。血液是通过前腔静脉采集的。血液和血清样本在兽医诊断实验室(密苏里大学哥伦比亚分校，MO, USA)进行分析。全血计数(CBC)包括分析白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和血小板(PLT)。测定血清葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、CREA、钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、球蛋白(Glob)、钙(Ca)、磷(Phos)、镁(Mg)、总胆红素(T Bil)、直接胆红素(D Bili)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ -谷氨酰转肽酶(GGT)、肌酸磷酸激酶(CPK)。第二天(第22天)，取其余两个重复的血液样本，处理方法与第一组相同。由于尸检地板上的时间限制，猪被放血后分两组杀死。gydF4y2Ba

第21天，对所有猪和饲料进行称重，计算平均增重(BWG)、平均采食量(FI)和饲料系数。在第22天，前三个重复的猪通过捆绑螺栓实施安乐死，然后放血，之后在兽医诊断实验室(密苏里大学哥伦比亚分校，MO, USA)进行尸检。最后两个重复的猪在试验第23天以与第一组相同的方式安乐死。gydF4y2Ba

尸检时，取下每头猪的肝脏和肾脏，称重计算相对重量(器官重量/体重)。从每头猪身上取肝脏、肾脏和肌肉(后四分之一)切片，用10%中性缓冲福尔马林固定，福尔马林购自Fisher Scientific (St. Louis, MO, USA)，用于组织病理学检查。对于组织病理学，组织也固定在Fisher Scientific (St. Louis, MO, UAS)的70%乙醇溶液中24小时，之后将组织放置在95%乙醇溶液中，直到组织被修剪以进行组织处理并保存。另外的肾脏和肌肉(后四分之一)以及胆汁样品被冷冻，以便稍后用高压液相色谱法(HPLC)分析MEL残留。gydF4y2Ba

每次治疗收集两只猪的尿液，并送到兽医诊断实验室(密苏里大学哥伦比亚分校，MO, USA)进行完整的物理/化学尿液分析(颜色、清晰度、比重、葡萄糖、胆红素、酮类、血红素、pH值、蛋白质试纸、SSA、尿胆素原、白细胞、红细胞、细菌、圆形细胞、鳞状细胞、铸模和晶体的存在)。gydF4y2Ba

另外购买了两头猪，以替代早期死亡的猪，并确保只使用高质量的猪进行实验。饲喂与试验猪相同的基础日粮。然而，在试验的第三天，由于没有发生死亡，额外的猪被喂食基础饲粮(与配制试验处理的基础饲粮相同)，其中含有0.75% MEL和0.75%三聚氰尿酸的组合，由Fisher Scientific (St. Louis, MO, USA;自保”)。另外两只猪的处理与实验猪相同。采食量、增重及所有组织收集和分析均与实验猪相同。额外饲喂组合饲粮的目的是获得肾脏晶体(MEL- cya)，以与仅饲喂MEL的猪可能出现的晶体进行比较。额外的猪(MEL + CYA)不包括在任何统计分析中，当使用治疗组来描述MEL对母猪的影响时，也不包括在统计分析中。gydF4y2Ba

三聚氰胺的分析gydF4y2Ba

如果没有特别说明，所有化学物质均从Fisher Scientific (St. Louis, MO, USA)获得。从组织和胆汁中提取MEL的程序是根据先前描述的方法[25]开发的，并涉及通过紫外检测的高效液相色谱法。对于肾脏和肌肉，在1g组织中加入10ml水:乙腈(1:2)，组织在50ml锥形离心管中均质30秒(BioHomogenizer, Bispec Products Inc.， Bartlesville, OK, USA)。然后将匀浆后的样品(Dynac II离心机，Clay Adams, Sparks, MD, USA)在180 × g下离心5分钟，将上清液转移到微离心管中，并在8200 × g下进一步离心(spectrafge 16M, Labent International, Woodbridge, NJ, USA) 5分钟。上清液通过MycoSep 224 AflaZon清理柱(Romer Labs, Union, MO, USA)。最后将500µL洗脱液用缓冲液(BUFF;将1.924 g柠檬酸和2.34 g辛烷磺酸(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶解于1 L蒸馏水中，用NaOH调节pH为3)，然后进行HPLC分析。gydF4y2Ba

对于胆汁，提取包括将200µL胆汁加入1800µL乙腈水(1:2)中，涡旋并将样品转移到微离心管中，离心(Spectrafuge 16M, Labent International, Woodbridge, NJ, USA)，离心5min (8,200 x g)。收集上清并通过MycoSep 224 AflaZon清理柱(Romer Labs, Union, MO, USA)。最后，将500µL洗脱液用BUFF 1:1稀释，进行高效液相色谱(HPLC)分析。gydF4y2Ba

MEL分析在商用高效液相色谱系统上进行，该系统由日立L-7100型泵与L-7485型紫外检测器，日立L-7200型自动进样器与日立D-7000数据采集接口和ConcertChrom软件(日立，东京，日本)上的微型计算机(日立，东京，日本)与HyperClone C组成gydF4y2Ba_18gydF4y2Ba专栏(美国加利福尼亚州托伦斯市phenomenex;100 × 4.60 mn)，流速为1 mL/min。在240 nm处进行紫外检测，流动相为BUFF:乙腈(ACN;87:13)。gydF4y2Ba

用BUFF: ACN(1:1)稀释2000 ppm MEL溶液的初级标准品，制备1、5、10和20 ppm MEL标准品。在每组样品前后运行MEL标准，并用于计算标准曲线。计算曲线下的面积，绘制在标准曲线上，并用于计算样品中单个MEL浓度。检测限设定为8.0 ppm。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用Statistical Analysis Software的一般线性模型程序对数据进行分析[26]。动物为实验单位。方差分析中显示显著差异的变量使用Fisher的保护最小显著差异程序进行比较[26]。对所有数据进行回归分析，确定线性(ygydF4y2Ba_我gydF4y2Ba= a + bxgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba+ EgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)或二次(y)gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba= a + bxgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba+残雪gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba+ EgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)反应。P值≤0.05时，可以接受有统计学意义。一个日志gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba对肾脏MEL残留数据进行变换，再进行统计分析。在进行分析之前，对肌肉中MEL残留水平的数据进行排序[27]。未对排序数据进行回归分析。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

性能和死亡率gydF4y2Ba

MEL对体重增重、FI、饲料系数和死亡率的影响见表2。单独饲喂MEL的猪和另外2头饲喂MEL + CYA组合的猪在治疗期间均未发生死亡。增重和平均日增重随饲粮MEL浓度的增加呈线性降低(P = 0.0005)。与对照组相比，饲粮中添加≥1.00% MEL降低了增重和平均日增重(P = 0.0205)。MEL + CYA组合饲喂的增重猪18日体重为7.76 kg，平均日增重为0.43。gydF4y2Ba

表2。gydF4y2Ba三聚氰胺对犊牛生产性能和器官重量的影响gydF4y2Ba

1. 治疗方法是在基础饮食中添加三聚氰胺(百分比)。除MEL + CYA猪饲喂18 d外，其余试验饲粮饲喂21 d。gydF4y2Ba
2. 数据是指五个重复的笔，每个笔一个barrow。gydF4y2Ba
3. MEL + CYA饲喂猪的值不包括在统计分析中。饲粮在基础饲粮中添加0.75% MEL和0.75% CYA。gydF4y2Ba
4. 方差值的单向分析。gydF4y2Ba
5. 回归:线性(L)或二次(Q)回归。gydF4y2Ba
6. 没有共同上标的列内的平均值不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

BWG =增重;ADG =平均日增重;FI =采食量;G:F =饲料增重;RLiver =相对肝脏重量;RKidney =相对肾重;MEL =三聚氰胺;氰尿酸。gydF4y2Ba

随着饲粮MEL浓度的增加，饲粮增重的下降既有线性因素(P = 0.0076)，也有二次因素(P = 0.0407)。饲粮中添加1.25% MEL的猪料重比低于对照组(0.53 vs 0.63) (P = 0.0427)。MEL + CYA组合增重猪的料重比为0.51。饲粮中添加1.25% MEL对FI没有影响(P = 0.7769)。gydF4y2Ba

器官重量gydF4y2Ba

表2总结了饲粮MEL对仔鸡器官重量的影响。饲粮MEL对肝脏质量、肾脏质量、相对肝脏质量(占体重的%)和相对肾脏质量(占体重的%)无显著影响(P > 0.05)。gydF4y2Ba

对照猪和单独饲喂MEL的猪之间器官重量的相似性与图1形成鲜明对比，图1描绘了对照猪(标签26)和MEL + CYA组合饲喂的猪(标签2)的肾脏。MEL + CYA组合饲喂的猪的肾脏比对照猪的肾脏外观更大，颜色更浅。MEL + CYA组合对肾脏重量的影响也很明显，在对照组和MEL + CYA组合饲喂的猪之间的相对肾脏重量(0.56% vs 1.15%)。gydF4y2Ba

图1所示。gydF4y2Ba三聚氰胺与三聚氰尿酸的组合对小鼠肾脏的影响。左侧的肾脏(标签2)来自于饲粮中含有0.75% MEL和0.75% CYA的猪。右侧的肾脏(标签26)来自饲喂基础日粮而不添加MEL的猪(对照猪)。gydF4y2Ba

全血细胞计数gydF4y2Ba

表3总结了CBC的结果。WBC、RBC、HGB、HCT、MCHC、PLT治疗组间差异无统计学意义(P > 0.05)。随着饲粮MEL浓度的增加，MCH (P = 0.0393)和MCV (P = 0.0068)呈线性降低。饲粮MEL含量为0.75 (54.08 fL)和1.25% (54.56 fL)的猪MCV低于对照组的MCV (59.80 fL)。MEL + CYA组猪的白细胞计数比对照组高66%，比1.25% MEL组高60%。gydF4y2Ba

表3。gydF4y2Ba三聚氰胺对犊牛血液指标的影响gydF4y2Ba

1. 治疗方法是在基础饮食中添加三聚氰胺(百分比)。除MEL + CYA猪饲喂18 d外，其余试验饲粮饲喂21 d。gydF4y2Ba
2. 数据是指五个重复的笔，每个笔一个barrow。gydF4y2Ba
3. MEL + CYA饲喂猪的值不包括在统计分析中。饲粮在基础饲粮中添加0.75% MEL和0.75% CYA。gydF4y2Ba
4. 方差值的单向分析。gydF4y2Ba
5. 回归:线性(L)或二次(Q)回归。gydF4y2Ba
6. 没有共同上标的列内的平均值不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

白细胞计数;红细胞计数;HGB =血红蛋白;HCT =红细胞压积;MCV =平均红细胞体积;MCH =平均红细胞血红蛋白;MCHC =平均红细胞血红蛋白浓度;PLT =血小板计数;全血细胞计数;梅尔·=三聚氰胺; CYA = cyanuric acid.

血清化学gydF4y2Ba

表4和表5总结了大型动物最大剖面的治疗方法。血清BUN、CREAT、ALB、GLOB、T Bili、D Bili、TP、GGT和CPK的浓度不受MEL单独浓度的影响。随着饲粮MEL水平的升高，血清GLU呈线性降低(P = 0.0124)。相反，随着饲粮MEL水平的升高，AST呈线性升高(P = 0.0049)。MEL + CYA组血清BUN水平分别是对照组的11倍和1.00% MEL组的12倍。MEL + CYA组合饲粮猪的平均CREAT水平也比对照组和1.25% MEL饲粮猪高7倍。血清P、Mg、Na、K和Cl浓度不受MEL浓度的影响。随着饲粮MEL浓度的增加，血清钙水平呈线性下降(P = 0.0053)。gydF4y2Ba

表4gydF4y2Ba．三聚氰胺对幼鼠血清蛋白、胆红素及选择性酶的影响gydF4y2Ba

1. 治疗方法是在基础饮食中添加三聚氰胺(百分比)。除MEL + CYA猪(2头)饲喂18 d外，其余试验饲粮饲喂21 d。gydF4y2Ba
2. 数据是指五个重复的笔，每个笔一个barrow。gydF4y2Ba
3. MEL + CYA饲喂猪的值不包括在统计分析中。在基础日粮中添加0.75% MEL和0.75% CYA。gydF4y2Ba
4. 方差值的单向分析。gydF4y2Ba
5. 回归:线性(L)或二次(Q)回归。gydF4y2Ba

GLU =葡萄糖(mg/dL);谷草转氨酶(U/L);BUN =血尿素氮(mg/dL);CREAT =肌酐(mg/dL);TP =总蛋白(g/dL);GLOB =球蛋白;总胆红素(mg/dL);D BILI =直接胆红素(mg/dL);ALB =白蛋白(g/dL);GGT = -谷氨酰转肽酶(U/L); CPK = creatine phosphokinase (U/L); MEL = melamine; CYA = cyanuric acid.

表5所示。gydF4y2Ba三聚氰胺对犊牛血清矿物质浓度的影响gydF4y2Ba

1. 治疗方法是在基础饮食中添加三聚氰胺(百分比)。除MEL + CYA猪(2头)饲喂18 d外，其余试验饲粮饲喂21 d。gydF4y2Ba
2. 数据是指五个重复的笔，每个笔一个barrow。gydF4y2Ba
3. MEL + CYA饲喂猪的值不包括在统计分析中。在基础日粮中添加0.75% MEL和0.75% CYA。gydF4y2Ba
4. 方差值的单向分析。gydF4y2Ba
5. 回归:线性(L)或二次(Q)回归。gydF4y2Ba

Ca =钙(mg/dL);P =磷(mg/dL);Mg =镁(Mg /dL);Na =钠(mEq/L);K =钾(mEq/L);Cl =氯(mEq/L);M =三聚氰胺;氰尿酸。gydF4y2Ba

验尿gydF4y2Ba

每次处理的两只猪的尿液分析显示，所测量的任何变量(清晰度、比重、葡萄糖、胆红素、酮类、血红素、pH值、蛋白质试纸(4+刻度)、尿胆红素原、白细胞、红细胞、细菌、圆形和鳞状细胞或铸型)均无差异。对照组、0.50% MEL组、0.75% MEL组和1.00% MEL组各有1头猪出现非晶态晶体。1.00% MEL组和1.25% MEL组各有1头猪出现尿中有刷石结晶体。饲喂1.25% MEL的一头猪出现了具有MEL结构外观的晶体(图2A)。图2显示了饲粮为1.25% MEL的猪与饲粮为MEL + CYA组合的猪尿液中晶体的相似性(图a和图B)。这些晶体在结构上与饲喂100 mg/kg MEL + 100 mg/kg CYA组合的年轻barrow中发现的晶体相似[23]。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2Ba在饲喂三聚氰胺和三聚氰胺与三聚氰尿酸混合物的猪的尿液中观察到结晶。饲喂1.25% MEL的猪的尿液中存在MEL晶体(a)。饲喂MEL和CYA组合的猪的尿液中观察到晶体(B)。对照猪尿液中的草酸钙晶体(C)。饲喂1.25% MEL的猪尿液中的磷酸钙晶体(D)。gydF4y2Ba

对对照组、1.25% MEL组和MEL + CYA联合组各1头猪的尿液进行分析。结果显示，对照组猪的尿液中存在草酸钙晶体(图2C)，饲喂1.25% MEL的猪的尿液中存在磷酸钙晶体(图2D)。在饲粮中添加1.25% MEL的猪和饲粮中添加MEL + CYA的猪的尿液中也发现了具有MEL结构外观的晶体。草酸钙晶体的临床价值不大，因为如果尿液标本放置不动，通常会出现草酸钙晶体[28]。磷酸钙结晶，又称刷石，可提示尿路感染，但其他方面临床价值不大[28]。gydF4y2Ba

MEL + CYA组合喂养的猪在尿液中均出现白细胞。尿液中还含有适量的晶体，与MEL-CYA复合物一致。测量的所有其他变量与MEL饲养猪的结果相似。gydF4y2Ba

组织残留gydF4y2Ba

表6总结了肾脏、肌肉(后四分之一)和胆汁中的MEL水平。随着饲粮MEL浓度的增加，肾脏中MEL浓度的增加存在线性(P < 0.0001)和二次(P < 0.0001)分量。饲粮中仅添加MEL的猪肾脏的残留水平高于对照组(P < 0.0001)。随着饲粮MEL浓度的增加，胆汁中MEL浓度呈线性增加(P < 0.0001)。饲粮中mel含量≥0.50%的猪肌肉(P < 0.0001)和胆汁(P < 0.0001)的残留水平均高于对照组。MEL + CYA组合喂养的猪肾脏中MEL的平均浓度为32 ppm，肌肉中为17 ppm，胆汁中为46 ppm。gydF4y2Ba

表格gydF4y2Ba6.幼鼠肾脏、肌肉和胆汁中的三聚氰胺浓度gydF4y2Ba

治疗gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba		响应变量gydF4y2Ba
三聚氰胺gydF4y2Ba		肾脏gydF4y2BabgydF4y2Ba	肌肉-后节gydF4y2BacgydF4y2Ba	胆汁gydF4y2BadgydF4y2Ba
（%）gydF4y2Ba		(ppm)gydF4y2Ba	(ppm)gydF4y2Ba	(ppm)gydF4y2Ba
基础日粮+ 0.00% MELgydF4y2Ba		NDgydF4y2BaDgydF4y2Ba	NDgydF4y2BaCgydF4y2Ba	NDgydF4y2BaCgydF4y2Ba
基础日粮+ 0.25% MELgydF4y2Ba		41gydF4y2BaCgydF4y2Ba	12gydF4y2BaCgydF4y2Ba	20.gydF4y2BaCgydF4y2Ba
基础日粮+ 0.50% MELgydF4y2Ba		75gydF4y2BaBgydF4y2Ba	33gydF4y2BaBgydF4y2Ba	63gydF4y2BaBgydF4y2Ba
基础日粮+ 0.75% MELgydF4y2Ba		75gydF4y2BaBgydF4y2Ba	33gydF4y2BaBgydF4y2Ba	77gydF4y2BaBgydF4y2Ba
基础日粮+ 1.00% MELgydF4y2Ba		143gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	62gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	85gydF4y2BaBgydF4y2Ba
基础日粮+ 1.25% MELgydF4y2Ba		125gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	57gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	126gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba
0.75%mel + 0.75%cyagydF4y2BaegydF4y2Ba		32gydF4y2Ba	17gydF4y2Ba	46gydF4y2Ba
方差分析:gydF4y2BafgydF4y2Ba	S.E.M.gydF4y2Ba	0.06gydF4y2Ba	2gydF4y2Ba	9gydF4y2Ba
	PgydF4y2Ba价值gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba
回归:gydF4y2BaggydF4y2Ba	李:gydF4y2BaPgydF4y2Ba价值gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	-gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba
	问:gydF4y2BaPgydF4y2Ba价值gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	-gydF4y2Ba	0.6718gydF4y2Ba

1. 治疗方法是在基础饮食中添加三聚氰胺(百分比)。除MEL + CYA猪(2头)饲喂18 d外，其余试验饲粮饲喂21 d。gydF4y2Ba
2. 数据是指四个重复的笔，每个笔一个barrow。对转换后的数据进行统计分析(log10)。gydF4y2Ba
3. 数据是指四个重复的笔，每个笔一个barrow。对转换后的数据(排序数据)进行统计分析。gydF4y2Ba
4. 数据是指五个重复的笔，每个笔一个barrow。gydF4y2Ba
5. MEL + CYA饲喂猪的值不包括在统计分析中。在基础日粮中添加0.75% MEL和0.75% CYA。gydF4y2Ba
6. 方差值的单向分析。gydF4y2Ba
7. 回归:线性(L)或二次(Q)回归。gydF4y2Ba
8. 没有共同上标的列内的平均值不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
9. 治疗方法是在基础饮食中添加三聚氰胺(百分比)。除MEL + CYA猪(2头)饲喂18 d外，其余试验饲粮饲喂21 d。gydF4y2Ba
10. 数据是指四个重复的笔，每个笔一个barrow。对转换后的数据进行统计分析(log10)。gydF4y2Ba
11. 数据是指四个重复的笔，每个笔一个barrow。对转换后的数据(排序数据)进行统计分析。gydF4y2Ba
12. 数据是指五个重复的笔，每个笔一个barrow。gydF4y2Ba
13. MEL + CYA饲喂猪的值不包括在统计分析中。在基础日粮中添加0.75% MEL和0.75% CYA。gydF4y2Ba
14. 方差值的单向分析。gydF4y2Ba
15. 回归:线性(L)或二次(Q)回归。gydF4y2Ba
16. 没有共同上标的列内的平均值不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
17. MEL =三聚氰胺;氰尿酸;ND =未检测到。gydF4y2Ba

病理gydF4y2Ba

生产总值(gdp)病理gydF4y2Ba

在21天的试验期内(表2)，包括MEL + CYA联合饲喂18天的猪，均未发生死亡。在终止时，单独饲喂MEL的猪的肝脏和肾脏大小或颜色没有差异。饲喂1.25% MEL的猪的胆汁在显微镜下未见结晶体。gydF4y2Ba

2021年猪的肝脏。版权所有，与对照猪有显著差异。然而，MEL + CYA组合喂养的猪的肾脏比对照组猪的肾脏大82%，肾脏呈淡黄色。图1显示了MEL + CYA组合喂养猪(标签2)和对照组猪(标签26)肾脏大小和颜色的鲜明对比。肾横切面可见肾髓质内大量细小的黄色晶体(图3)。gydF4y2Ba

图3。gydF4y2BaMEL和CYA联合用药对幼仔母猪肾脏的影响。饲粮MEL和CYA(每种化合物含量为0.75%)18 d的猪肾脏横切面。黄色到金色的细晶体(箭头)。gydF4y2Ba

组织病理学gydF4y2Ba

肝脏、肾脏和肌肉的评估显示，对照组和单独饲喂MEL的猪没有变化。图4显示，对照猪(图4A)和饲喂1.25% MEL的猪(图4B)肾脏没有微观变化。对照猪、饲粮1.25% MEL的猪和饲粮MEL + CYA组合的猪的胆汁镜检均无结晶体。然而，三只猪，一只来自1.00% MEL组，两只来自1.25% MEL组，在肝脏、肾脏和肌肉出现了病因不明的多灶性中度至重度化脓性亚急性炎症(可能是由于细菌感染)，但炎症似乎与MEL消耗没有直接关系。gydF4y2Ba

图4。gydF4y2Ba三聚氰胺在鼠肾中的微观效应。饲喂基础日粮不添加MEL的猪的肾脏(对照猪，a)。饲喂基础日粮加1.25% MEL的猪的肾脏(B)。gydF4y2Ba

MEL + CYA联合饲喂的猪肝脏无显微病变。肾脏则有肾小管变性，在肾小管腔内可见大量晶体。晶体呈金棕色至黄色，呈圆形，辐条从中心发散(图5A-D)。gydF4y2Ba

图5。gydF4y2Ba组合的影响gydF4y2Ba幼鼠肾脏中MEL和CYA的含量。在组合饲养猪的肾脏(A和B)可见金棕色径向球形晶体。这些晶体在偏振光下可见(C和D)。gydF4y2Ba

还确定，虽然在福尔马林和乙醇中固定的组织具有相似的显微特征，但乙醇固定在组织中保存晶体稍好。在福尔马林和乙醇中固定的组织中晶体总数相似。然而，福尔马林固定组织中的晶体容易断裂，在组织中留下空隙。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

当MEL水平分别为饲粮的1.00%和1.25%时，体重增重和饲料增重是唯一显著低于对照组的性能变量。饲粮中添加1.00%和1.25% MEL的犊牛增重分别比对照组低3.26和3.32 kg。虽然1.00和1.25% MEL处理组的体重增加明显减少，但没有发生死亡率，并且FI虽然在MEL组中数值较低，但没有显著降低。这表明，尽管饲粮中MEL用量≥1.00%并不致命，但犊牛的生产性能会降低。这些数据与之前对猪和家禽的研究一致:1)饲粮200 mg/kg体重/天(?0.50%的日粮添加量对日增重无影响[23];2)饲粮≥1.0% MEL导致肉仔鸡[25]和鸭[29]采食量和增重下降;3)饲粮中添加1.5% MEL可降低雏鸡增重[30]。gydF4y2Ba

血尿素氮(BUN)是尿素或蛋白质代谢的最终产物，由肾脏排出[31]。因此，BUN与蛋白质摄入、氮代谢、肾脏排泄率有直接关系，可用于肾功能的测定[31]。肌酐(CREAT)是肌肉代谢产生的废物[32]，由肾脏从体内清除[31]。在本研究中，单独饲喂MEL的猪的BUN和CREAT浓度与对照组没有差异，其值在(±0.6)参考范围内或附近[33]。这表明，在肾脏大小(肾脏重量或相对肾脏重量)和肾脏外观(肉眼或显微镜下)没有变化的情况下，饮食中高达1.25%的MEL似乎不会影响年轻barrows的肾脏功能。饲喂400 mg/kg BW (?MEL至16周龄猪，肾脏未见明显病变，BUN和CREAT水平均在正常范围内[22]。另一项研究报告说，饲粮200毫克/公斤体重/天的母猪(?结果显示，在任何测量变量(体重、平均相对肾脏重量、BUN或CREAT)上，处理间均无差异[22]。当给大鼠喂食高达18000 ppm(饮食的1.8%)MEL 13周时，我们注意到雄性大鼠的肾脏不受MEL的影响[34]。 It was reported that slightly higher levels of MEL (1.5%) than was used in the current study caused mild accumulation of spherical basophilic crystals in the collecting ducts and collecting tubules of broilers [25]. In poults, feeding ≥ 1.00% MEL caused gross pathology that was associated with renal failure, while feeding ≥ 2.0% MEL caused ? 63 % mortality [30].

尿液分析显示，在测量的任何变量之间没有差异。在不同的处理中，只有刷石(磷酸钙)、草酸钙和无定形晶体的存在不同。从目前的分析中鉴定出的无定形晶体很可能是无定形尿酸盐或无定形磷酸盐晶体。然而，磷酸钙和草酸钙以及无定形(尿酸盐或磷酸盐)晶体的存在似乎与治疗无关，通常没有什么临床价值[28]。一只饲粮中添加1.25% MEL的猪尿液中出现晶体，与另一项饲粮中添加MEL + CYA的猪所描述的晶体相似[23]。此外，1.25% MEL猪的晶体与本研究中MEL + CYA组合喂养猪的晶体相似。先前的研究表明，仅饲喂MEL的猪晶体的MEL:CYA比例为1:1[23]。随着微生物将MEL转化为CYA的能力被证实[5,35]，需要更多的研究来证实MEL转化为CYA是否可以由哺乳动物胃肠道中的微生物完成[23]，或者MEL是否可以被哺乳动物代谢为CYA。gydF4y2Ba

各组平均红细胞体积(MCV)差异有统计学意义。平均红细胞血红蛋白(MCH)随着饲粮MEL水平的增加呈线性下降，血清天冬氨酸转氨酶(AST)随着MEL水平的增加呈线性上升。然而，所有处理的猪MCV和AST值都保持在正常范围内[33]。所有处理的MCH值也接近参考范围(±0.68)[33]。gydF4y2Ba

MEL浓度最高的是肾脏和胆汁。肌肉中的MEL浓度大约是肾脏和胆汁中MEL浓度的一半。例如，饲喂1.25% MEL的猪的肾脏MEL浓度为125 ppm，而肌肉MEL浓度仅为57 ppm。肾脏中较高的MEL浓度与先前的研究报告一致[11,12]，先前的研究报告指出，MEL和CYA复合物在肾脏中的沉淀可能是由于这些化合物沿渗透梯度向下移动时浓度的增加[12]。因此，有理由认为肾脏中的MEL浓度高于其他组织，因为肾脏将不需要的化合物(MEL)从血液中过滤出来并进入尿液，从而使该化合物变得更加浓缩。胆汁的MEL值与肾脏相似，这一事实表明，胆汁是猪体内的一种排泄途径。胆汁作为消除MEL的途径也被认为发生在家禽中[25,29,36]。gydF4y2Ba

饲粮中添加1.00% MEL的肉鸡和家禽的乳腺、肾脏和胆汁组织中MEL残留水平[30]高于本研究报告的水平。家禽和猪之间MEL残留量的差异可能是由于肾脏生理的差异以及家禽和猪对MEL的吸收和加工方式的差异。另一种可能的解释是3周大的鸟和8周大的手推车之间的大小差异。假设同样的MEL被吸收，MEL会更集中在较小的(?550克)的鸟比大的(?21730克)手推车。8周龄猪和3周龄鸭采食量的差异也可以解释MEL残留水平的差异。其他可能的解释包括:1)不同物种从胃肠道吸收和运输MEL到体内的方式不同;2) MEL如何被肝脏过滤的差异;3)肝胆再循环发生的程度; 4) differences in the kidneys’ ability to filter MEL from the blood; and 5) the ability of the kidneys to excrete MEL into the urine without precipitation occurring. Water flow through the kidney could be a major factor in the ability of the kidney to excrete MEL into the urine without precipitation occurring, thus decreasing renal damage. Therefore, animal species with higher water consumption resulting in larger urine output might be better able to flush MEL out of their kidney, thus preventing precipitation.

MEL + CYA(每种组合添加量为0.75%)组合饲喂的猪生产性能明显低于仅添加0.75% MEL的猪。MEL + CYA组合饲喂的猪相对肾脏重量显著增加(约为对照组的两倍)。MEL + CYA联合饲喂的猪的BUN和CREAT等血液参数也远高于对照组(分别高出11倍和7倍)，表明肾功能衰竭。MEL + CYA联合喂养的猪白细胞计数和尿中白细胞均升高。MEL + CYA联合喂养的猪的肾脏显微镜检查显示肾管变性和金棕色到黄色的晶体。MEL + CYA猪的晶体在偏振光下可见，这一特征与先前描述的MEL + CYA晶体一致[10,11,22,30]。这些数据与先前的研究一致，MEL和CYA的组合被证明比MEL单独使用对哺乳动物的毒性更大[11,12,22,23]。然而，在家禽中，在含有MEL的日粮中添加CYA可以减少MEL对采食量和体重增加的负面影响[30]。此外，在含有MEL的日粮中添加CYA似乎可以改善MEL对幼雏北京鸭生产性能和死亡率的负面影响[36]。gydF4y2Ba

MEL + CYA组合饲粮猪的肾脏、肌肉和胆汁中MEL残留量低于0.75% MEL饲粮猪的组织。这表明，虽然MEL和CYA的组合对猪的毒性更大，但与单独使用MEL相比，胃肠道对MEL-CYA酸复合物的吸收更少。由于MEL- cya在胃肠道中的沉淀，MEL- cya复合物的生物利用度与单独使用MEL相比有所下降，此前已有报道[22]。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

综上所述，饲粮中添加0.75% MEL对饲喂21 d的仔鸡无毒性。饲粮中MEL水平为1.00%和1.25%会降低幼垄的生长性能。根据血清BUN和CREAT水平以及组织病理学结果，似乎对肾功能没有治疗效果。这些结果与在哺乳动物身上进行的类似实验的结果一致[22,23,34]。肾脏和胆汁中的残留水平表明，MEL可以通过猪的胆汁和肾脏排出。以前曾有人建议在家禽中使用肝胆系统作为另一种消除途径[30]。需要更多的研究来确定MEL转化为CYA是否可以通过哺乳动物胃肠道中的微生物和/或哺乳动物的代谢发生。最后，MEL和CYA的组合(每种化合物的0.75%)比单独饲喂1.25% MEL的仔猪毒性更大。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明不存在利益冲突。gydF4y2Ba

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