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摘要

野生山羊“牛黄”(Capra aegagrus)被认为是家山羊(C. hircus)祖先的最强候选。本文描述了Mahabadi山羊线粒体DNA位移环(D-loop)区域的完整序列。控制区(D-loop)是线粒体基因组中最易变的非编码部分。利用线粒体DNA序列分析了Mahabadi山羊群体的遗传多样性和系统发育结构。根据mtDNA估计了本地山羊与山羊祖先的遗传距离。最近对大多数家山羊个体的分析显示，家山羊共有6个不同的单系线粒体DNA (mtDNA)单倍群a、B、C、D、F和G，其中a单倍群占90%以上。利用30只动物的高变区1 (896 bp)进行系统发育分析。所有的Mahabadi单倍型均被归为A单倍型群，与来自不同地区的其他山羊群体相比，在群体内显示出显著的遗传距离，表明Mahabadi山羊具有较高的遗传变异。提取DNA后，用特异性引物PCR扩增mtDNA位移环(d环)区，纯化后测序。根据从GenBank中获得的不同山羊品种和野生山羊“牛黄”(Capra aegagrus)相似序列的一致序列绘制系统发育树。 In the phylogenic tree, Mahabadi native goat was clustered with Switzerland, Romania, Austria, Cyprus, Jordan, Spain, Saudi Arabia, Albania, Turkey, Egypt, Kurdi Iran, Malaysia, Kyrgyzstan, Italya and ancestor of native goat breeds. The findings confirmed that Mahabadi goats was closed to Capra aegagrus compared to other domestic goats.

关键字

遗传多样性，黑山羊，马哈巴迪山羊，mtDNA，系统发育，遗传距离。

介绍

家养山羊(Capra hircus)是世界上许多地方，特别是非洲和亚洲最重要的农场动物之一。山羊被认为是在公元前九千年和八千年的前陶器新石器时代(PPNB)时期被驯化的，特别是在公元前8700年和6800年之间的扎格罗斯山脉，它以其耐寒性而闻名，山羊已经适应了许多不同的栖息地，包括稀树草原，沙漠，灌木丛和山脉，并在所有类型的生态环境中被发现，特别是在热带和干燥地区，其他牲畜物种难以生存。山羊被包括在整个生产系统中，从集约化生产到小农和游牧人口，并在世界各地饲养，以获取其肉、奶、奶酪、纤维和皮革。山羊也被当作宠物或娱乐、文化和宗教目的而饲养。安哥拉山羊只有一种颜色，从白色到银色，但马哈巴迪山羊生产的马海毛有不同的自然颜色，这是该品种的独特特征。在此基础上，本研究对马哈巴迪山羊的系统发育现状和遗传多样性进行了研究，以了解该品种的遗传基础。线粒体基因组(mtDNA)分析是进化和群体遗传学(包括分子遗传学)领域的重要工具。线粒体DNA (mtDNA)多态性，特别是位移环(D-loop)区域，已被广泛应用于了解许多动物物种的系统发育关系，包括牛[1]、猪[2]、羊[3]、鸡[4]、马[5]和山羊[6,7,8]。先前对家山羊的研究发现了至少四种主要的mtDNA谱系[9,10,11]。血统A是最多样化的，广泛分布在各大洲。

本文描述了来自家山羊和几种家山羊以及本地山羊祖先“Capra aegagrus”的线粒体DNA位移环(D-loop)区域的完整序列。控制区(D-loop)是线粒体基因组中最易变的非编码部分[12]。该区域通过调节核基因编码的各种酶和蛋白质的活性来控制线粒体DNA (mtDNA)的复制[13]。在不同的哺乳动物物种中，控制区的序列差异很大，然而，一些保守区域的保存表明其功能基本一致[14]。由于控制区序列的快速进化[15]，对研究物种间的遗传多样性和进化关系具有重要价值[12]。家畜物种遗传变异的程度和模式将有助于家畜遗传资源的保护。在上述考古研究和生物地理学的基础上，对伊朗山羊多样性的分子研究可能会对山羊驯化的起源和过程有新的认识，并有助于解决山羊的系统发育问题。伊朗有20多个山羊品种，这些小山羊品种分布在伊朗西部和西北部靠近土耳其和伊拉克边境的地方。

山羊属的三种野生物种牛黄(C. aegagrus)、markhor (C. falconeri)和ibex (C. ibex)与家山羊(C. hircus)有密切的亲缘关系，这些物种可能通过早期动物易位和山羊全球传播之前的杂交，对家山羊的基因库做出了贡献。

现在人们普遍认为C. aegagrus是家养山羊的野生祖先，这一发现已经被现有C. aegagrus种群中所有“家养”单倍群的存在所证实。被称为野山羊(Capra aegagrus)的牛科动物是家山羊的祖先，尽管家山羊可能与亚洲其他野生山羊品种杂交。野生山羊在西亚被发现(自1970年引进以来，在美国新墨西哥州也存在500至1000只的自由漫游种群，通过狩猎维持)。它们生活在海拔4000米左右(但通常低于2500米)与悬崖有关的岩石栖息地。尽管在达吉斯坦，它们栖息在一些山地森林中，但通常野生山羊与沙漠和半干旱地区有关。在野生山羊占据的大部分地区，灰狼(Canis lupus)和豹子(Panthera pardus)等自然捕食者已经灭绝。本文报道的核苷酸序列数据将出现在GenBank序列数据库Capra aegagrus中，登录号为AB004076.1。最近对2430个家山羊个体的分析发现，共有6个不同的单系线粒体DNA (mtDNA)单倍群a、B、C、D、F和G，其中a单倍群占个体的90%以上。Luikart等人[14]发现的三个山羊(C. hircus) mtDNA单倍群(A、B和C)(图1)已被解释为表明三个不同的驯化事件。通过对比从地区HVR1-of-breed山羊获得的序列，Nader等人在2009年的研究中以这六组单倍型的Mahabad序列作为参考序列，在该研究中，属于单倍型a群的Mahabadi山羊以表格的形式进行分析(表1)。

表1。Mahabadi山羊种群HVR1序列单倍型多样性系统发育树

图1。单倍型群体在世界各地山羊物种的频率

假设每个单倍群都驯化了一个单倍型，最常见的a单倍群的合并时间为1万年，那么假设B和C单倍群的驯化分别发生在大约2130年和6110年前。一些作者解释了这一结果(Luikart et al. 2001;Amills et al. 2009)[14,15][16,17]，因为山羊由于体型适中，能够适应不同的环境，非常适合古代的洲际运输。本研究在前人文献的基础上，基于线粒体DNA D-Loop区对Mahabadi山羊群体进行分子分析，开发用于品种鉴定的分子标记。在这种情况下，我们的Mahabadi山羊的目标是通过对mtDNA多态性的广泛分析来更好地了解驯化过程。更具体地说，通过在野外进行广泛和控制良好的采样，我们的目标是通过找到与家养种群相比具有最接近基因型的当今野生种群来定位假定的驯化中心。(Naderi et al. 2007)[16][18]。使用MEGA6中的ClustalW对三个数据集的所有片段进行了对齐和修剪，选择了在农业生产系统中发挥重要作用的家山羊(Capra hircus)，因为它们是从野生祖先牛黄(Capra aegagrus)驯化而来。对驯化过程所带来的遗传后果的详细了解仍然是进化基因组学的一个关键目标。分析了以家山羊为祖先的10个经济上重要的地方山羊品种。

所有被研究的物种在表型上彼此不同，地理范围也非常不同。研究了这些山羊品种的遗传多样性和线粒体单倍群分布，并评估了来自不同驯养中心的山羊种群的母系基因渗入水平。最后，为了支持我们的遗传数据，并开始详细记录伊朗卡普拉的生物多样性，我们评估了C. aegagrus是Mahabadi家山羊的野生祖先的假设。家山羊有时被称为山羊，但Valdez(2011)将家山羊视为一个独特的物种，山羊。野生山羊在世界各地的分布比真正的野生山羊要广泛得多。克里特岛和附近岛屿上的特有山羊，通常被称为C. aegagrus cretica，看起来与野生的C. aegagrus很相似，但基因分析表明，事实上，正如一些研究人员所怀疑的那样，它们实际上是野生家养山羊的后代，来自于很早以前的引进。

材料和方法

我们从Mahabadi山羊身上采集了本地山羊的血液样本。血液样本(5ml EDTA)

随机收集20只动物，保存在-20°C，直到在生物技术实验室使用。我们扩增了参考山羊线粒体基因组AF533441中位于15,653和16,250位置之间的598 bp的线粒体高可变区1 (HVR1)片段。DNA提取、PCR扩增及测序。

我们从Mahabadi山羊身上采集了本地山羊的血液样本。采用正向引物HVR1- f: 5扩增HVR1全区َ-CTATCAACACACCCAAAGCTGAA-3َ反向引物HVR1-R:: 5َ-CGGAGCGAGAAGAGGGAT-3َ。正向引物和反向引物为设计的mtDNA基因组序列(GenBank登录号:V00654)。聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)的总体积为25 ul，其中含有基因组DNA 10 ug, 10ul缓冲液2.5 ul, dNTP 0.2 mM，每个引物10 pM, Taq聚合酶1.5单位(TaKaRa, Japan)。在PTC-200热循环器(MJ Research Inc.)上进行热循环，条件如下:在94°C下进行2分钟变性，然后在94°C下进行30秒变性，在60°C下进行30秒变性，在72°C下进行60秒变性，最后在72°C下进行5分钟变性，然后冷却到4°C持续10分钟。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，溴化乙啶染色后在紫外线照射下观察。PCR产物采用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen, USA)纯化，并在ABI 3130xl遗传分析仪(PE Applied Biosystems, USA)上直接测序，进行统计和系统发育分析。clstal W (Thompson等)对不同品种的HVR1区域序列进行了比对。, 1994)。在DNA序列多态性版本5.1 (Librado and Rozas,2009)中进行核苷酸多态性位点(S)和单倍型(h)、核苷酸多样性(Pi)、单倍型多样性(Hd)和核苷酸分化(Dxy)的数量分析[17][19]。以HVR1区域序列为基础，在MEGA 5.05包中重建了单倍型的Neighbor-joining (NJ)树(Saitou and Nei, 1987)[18][20]，并通过1000次bootstrap重复评估了树拓扑的可靠性。 The NJ tree among breeds was constructed in MEGA 5.05 package on the basis of divergence distances.

系统发育重建

利用BioEdit软件程序7.2版将获得的序列与国际基因库数据库进行比对，包括中国(KM 360063)、瑞士(KR059147)、意大利(KR059205)、约旦(KR059160)、伊朗(KR059191)、西班牙(KR059156)、奥地利(KR059180)、埃及(KR059159)、土耳其(KR059200)、塞浦路斯(KR059163)、沙特阿拉伯(KR059154)、罗马尼亚(K059198)、阿尔巴尼亚(KR059146)、吉尔吉斯斯坦(KR059122)、马来西亚(KR059220)和希腊卡普拉(AB004076.1)[21]。为了研究线粒体序列之间的遗传关系，使用Tamura-Nei距离法构建了一个无根邻居连接的系统发育[22][23,24-43]。MEGA封装版本包含距离计算和系统发育树构建。5.1(图2)。

图2。基于山羊品种HVR1区域的几种本地山羊及其祖先的系统发育关系。

结果与讨论

(Mahabadi山羊的mtDNA变异)

本研究对30只Mahabadi山羊的mtDNA控制区序列进行了分析，以进一步阐明其多样性。对照区30条HVRI序列无插入和缺失。HVRI序列具有高度多态性。我们的30个序列给出了7个不同的单倍型和44个可变位点。2个最大单倍型组6个个体，2个单倍型组3个个体，3个单倍型组4个个体(表1)。控制区序列平均碱基组成如下:A: 30.38%， C: 23.77%， G: 15.70%， T: 30.16%，单序列分子量为271807.00道尔顿，对分子量为540684.00道尔顿，表明山羊mtDNA控制区A/T含量高，控制区A/C含量丰富(图3)。这一结果表明，Mahabadi山羊的群间距离是使用MEGA 5.0软件计算的。根据得到的聚类结果，在组间进行样本分布。显然，KR059159(埃及)和KR059220(马来西亚)之间的距离最长。距离最短的是KR059205(意大利)、Capra aegagrus (AB004076.1)和Mabadi山羊。据报道，来自伊朗的本地山羊与国内山羊的祖先接近(图4)。对本地山羊mtDNA的序列分析显示，它们的遗传结构相对缺乏，这支持了先前山羊mtDNA多样性研究中观察到的主要趋势的地理分布。 A neighbor-joining and parsimony phylogenetic tree constructed using the sequences showed that the domestic goats of Iran and Italy and Spain and the bezoar belong to the same group that this result was confirmed by trees based on the sequence of the mitochondrial displacement loop regions. Phylogenetic analysis was carried out using hyper variable region 1 (896 bp). Mahabadi goat proved to be extremely diverse (average haplotype diversity of 0.999) and the nucleotide diversity values 0.022. These results indicate high-divergence status of the Mahabadi goat and will influence breeding and conservation strategies adopted for this breed (table 2). Distribution of the samples between the groups was made in accordance with the cluster obtained. This is possible because of geographical distance and it is distributed. The current study constitutes the first assessment of the genetic diversity and population structure of Mahabadi goat populations from the west of Iran and provides the first insights into the genetic history of native goat of Iran.

表2。马哈纳迪山羊种群控制区序列的多样性组成

图3。马哈巴迪山羊种群控制区序列的多样性组成

图4。几种本地山羊及其祖先的系统发育关系

确认

作者感谢三位审稿人对稿件提出的建设性意见。我们感谢所有参与本研究的农民，让他们有机会接触动物。该研究首次揭示了伊朗家山羊的遗传多样性和进化背景，为进一步研究家山羊种群的时间波动提供了基础。在未来的研究中纳入更多野生山羊或古代山羊的样本将为伊朗山羊种群的历史和基因流动提供更多的见解。

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